Come funziona il Western Blotting

Il western blotting è una tecnica in biologia molecolare utilizzata nella rilevazione di una specifica proteina all'interno di un campione. Usa SDS-PAGE per separare le proteine ​​in base alla loro dimensione e queste proteine ​​separate vengono poi trasferite in una membrana. Questa tecnica utilizza anticorpi primari specifici nell'etichettatura di una particolare proteina nella macchia. Anticorpi secondari etichettati con proteine ​​reporter rilevano le proteine ​​etichettate con l'anticorpo primario.

Aree chiave coperte

1. Cos'è il Western Blotting
     - Definizione, fatti, applicazioni
2. Come funziona il Western Blotting
     - Processo di Western Blotting

Termini chiave: sviluppo del colore, membrana di nitrocellulosa, anticorpo primario, anticorpo secondario, macchiatura occidentale

Cos'è il Western Blotting

Il western blotting è una tecnica di ibridazione utilizzata nella rilevazione di una particolare proteina all'interno di un campione. Viene anche chiamato immunoblotting poiché la tecnica utilizza anticorpi sia per l'etichettatura della proteina di interesse che per la rilevazione delle proteine ​​marcate con anticorpi.

Figura 1: Western Blot

Il western blotting è stato sviluppato per la prima volta da Towbin nel 1979 ed è attualmente utilizzato come tecnica di routine per l'analisi delle proteine. 

Come funziona il Western Blotting

Il western blotting viene utilizzato principalmente nella rilevazione di una specifica proteina in un campione. I passaggi della tecnica Western Blotting sono descritti di seguito.

1. SDS-PAGE - Il campione di proteine ​​viene separato in base alla loro dimensione mediante SDS-PAGE.
2. Trasferimento di proteine ​​su una membrana - Le proteine ​​frazionate in termini di dimensioni vengono trasferite in una membrana di nitrocellulosa o polivinilidendifluoruro (PVDF). Le tecniche coinvolte in questo trasferimento sono il trasferimento della diffusione.
3. Blocco di siti non specifici - I siti non occupati sulla membrana sono bloccati per impedire il legame non specifico delle proteine. A questo scopo possono essere utilizzati latte secco senza grassi o albumina di siero bovino (BSA).
4. Incubazione di anticorpi primari - La membrana bloccata viene incubata con una soluzione di anticorpi primaria. Questi anticorpi primari si legano a una particolare proteina sulla membrana.
5. Incubazione di anticorpi secondari - La membrana è incubata con anticorpi secondari, che si lega agli anticorpi primari. Gli anticorpi secondari sono coniugati con proteine ​​reporter. Queste proteine ​​reporter possono essere biotina, fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano.
6. Rilevazione delle proteine ​​mediante sviluppo del colore - I reporter enzimatici coniugati reagiscono con il loro substrato per generare una fosfatasi alcalina colorata e convertono il BCIP in un prodotto di colore blu mentre la perossidasi di rafano converte il luminolo, emettendo luminesce.

Figura 2: Western blotting - Procedura

Conclusione

Il western blotting è una tecnica di ibridazione utilizzata per rilevare la presenza di una particolare proteina all'interno di un campione. Utilizza SDS-PAGE per separare le proteine ​​in base alla loro dimensione e legame con gli anticorpi primari, che possono essere riconosciuti dagli anticorpi secondari durante lo sviluppo del colore.

Riferimento:

1. "Principio Fondamentale del Blotting Occidentale, come funzionano le Western Blot." Boster, Disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Immunoblot acido anti-lipoico" di TimVickers - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Western Blotting" di Cawang - Opera propria, CC0) via Commons Wikimedia