Perché la PCR viene utilizzata nel processo di sequenziamento del DNA
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Il sequenziamento del DNA è una tecnica utilizzata per determinare la sequenza nucleotidica di un particolare frammento di DNA. Sequenziamento di Sanger e sequenziamento di prossima generazione sono due tipi di metodi di sequenziamento. Marcatori fluorescenti sono utilizzati per identificare ogni nucleotide nella sequenza. La PCR viene utilizzata per incorporare i marcatori fluorescenti nel frammento di DNA. La PCR (polymerase chain reaction) è una tecnica utilizzata in laboratorio per produrre milioni di copie di un particolare frammento di DNA. L'analisi dei frammenti di PCR nel gel consente la determinazione della sequenza nucleotidica del frammento di DNA.
Aree chiave coperte
1. Cos'è il sequenziamento
- Definizione, Tipi di sequenziamento - Sequenza di prossima generazione, Sequenziamento di Sanger
2. Perché la PCR viene utilizzata nel processo di sequenziamento del DNA
- Incorporazione di coloranti fluorescenti durante la PCR
Termini chiave: ddNTP, dNTP, sequenziamento del DNA, coloranti fluorescenti, sequenziamento di prossima generazione, PCR, sequenziamento di Sanger
Cos'è il sequenziamento
Il sequenziamento è una tecnica di laboratorio utilizzata per determinare la sequenza nucleotidica di una molecola di DNA. Sequenziamento di Sanger e sequenziamento di prossima generazione sono i due principali metodi di sequenziamento del DNA. Entrambi i metodi di sequenziamento del DNA sono coinvolti nell'incorporazione di produttori fluorescenti al filamento di DNA mediante PCR per la determinazione della sequenza nucleotidica di un particolare filamento di DNA.
Sequenziamento di Sanger
Il primo metodo di sequenziamento, noto come sequenziamento di Sanger, è stato sviluppato per la prima volta da Fredric Sanger nel 1975. Di conseguenza, è noto come sequenziamento di Sanger. Il sequenziamento di Sanger è coinvolto nell'incorporazione selettiva di dideoxinucleotidi a catena (ddNTPS) mediante DNA polimerasi durante in vitro Sintesi del DNA Pertanto, è anche noto come metodo di terminazione della catena. I deossinucleotidi regolari (dNTP) vengono utilizzati per l'allungamento del filamento di DNA. I ddNTP vengono anche aggiunti alla miscela di reazione per la terminazione della crescita della catena. I quattro tipi di ddNTP sono aggiunti a quattro miscele PCR separate. Pertanto, vengono eseguite quattro reazioni PCR separate aggiungendo ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP. Per ogni miscela di reazione, un singolo tipo di ddNTP aggiunto (se ddATP è aggiunto), la crescita di diversi ampliconi viene terminata a ciascun (A) nucleotide nel frammento di DNA. Quindi le quattro reazioni vengono separate mediante elettroforesi su gel. La fluorescenza emittente viene rilevata da un fluorometro. Il sequenziamento di Sanger è ampiamente utilizzato per la determinazione della sequenza dei frammenti utilizzati nella clonazione del DNA e dei frammenti amplificati mediante PCR. La procedura generale del sequenziamento di Sanger è mostrata in Figura 1.
Figura 1: processo generale del sequenziamento di Sanger
Sequencing di nuova generazione
Il sequenziamento di prossima generazione è il nome collettivo per le più recenti tecnologie di sequenziamento del DNA. Diverse reazioni di sequenziamento sono eseguite su microscala su un chip contemporaneamente nel sequenziamento di prossima generazione. Entrambi i metodi di sequenziamento utilizzano nucleotidi marcati con fluorescenza che sono incorporati nell'amplicone durante la PCR, consentendo la determinazione della sequenza nucleotidica. L'aggiunta terminante a catena di marcatori fluorescenti è anche coinvolta nel sequenziamento di prossima generazione. Tuttavia, la principale differenza tra sequenziamento Sanger e sequenziamento di prossima generazione è l'uso dell'elettroforesi capillare per la separazione di ampliconi marcati in modo diverso nel sequenziamento di prossima generazione. L'elettroforesi capillare è un metodo di separazione analitica mediante il quale le molecole vengono separate in base alla loro mobilità elettroforetica.
Perché la PCR viene utilizzata nel processo di sequenziamento del DNA
Durante il sequenziamento, i marcatori fluorescenti dovrebbero essere incorporati nel filamento del DNA per la determinazione della sequenza nucleotidica. Questa incorporazione ha luogo durante la PCR. In generale, i quattro tipi di dNTP sono incorporati nel filamento di DNA di nuova sintesi durante la PCR. Questo fenomeno viene utilizzato nel sequenziamento del DNA per incorporare i didexinucleotidi marcati con fluorescenza (ddNTP) nell'amplicone mentre si determina la sequenza del DNA.
Generalmente, una miscela di quattro basi regolari (dNTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) viene aggiunta alla miscela di reazione PCR durante il sequenziamento del DNA.
Inoltre, uno dei quattro dideossinucleotidi (ddNTP, ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP) vengono aggiunti come componenti della reazione PCR a bassa concentrazione. Infine, devono essere eseguite quattro reazioni PCR per determinare la sequenza completa.
Figura 1: una sequenza di DNA determinata
Il I ddNTP mancano del gruppo 3'-OH a cui il nucleotide entrante è aggiunto dalla DNA polimerasi. Quindi, l'incorporazione del ddNTP termina la crescita della catena. Pertanto, in ciascuna delle quattro reazioni PCR, la terminazione della catena si verifica su una base particolare. Questi I ddNTP sono anche incorporati con diversi coloranti fluorescenti (Il ddATP è etichettato con colorante verde; il ddGTP è etichettato con colorante giallo; il ddCTP è etichettato con il blu, e il ddTTP è etichettato con colorante rosso). L'incorporazione dei coloranti fluorescenti e la terminazione della catena avvengono durante la PCR. Gli ampliconi vengono eseguiti su un gel e il gel viene scansionato per la fluorescenza da un fluorometro nel sequenziatore automatico per la determinazione della sequenza nucleotidica.
Conclusione
Il sequenziamento del DNA è una tecnica di laboratorio utilizzata per determinare la sequenza nucleotidica di un particolare frammento di DNA. Sequenziamento Sanger e sequenziamento di prossima generazione incorporano diversi coloranti fluorescenti nel frammento di DNA per la determinazione della sequenza nucleotidica durante un PCR.
Riferimento:
1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies." Nature News, Nature Publishing Group, disponibile qui.
2. "Sequencing DNA - Sequenziamento automatizzato con coloranti fluorescenti." Articoli JRank, disponibili qui.
Cortesia dell'immagine:
1. "Sequenziamento di Sanger - generale" Autore: Utente: Fibonachi - власна робота (CC BY-SA 1.0) via Commons Wikimedia [modificato] 2. "Sequenza di DNA" di Sjef - Opera propria (Dominio pubblico) via Commons Wikimedia
