Come rendere stabile la linea cellulare trasfettata

La transfezione stabile è l'introduzione a lungo termine di DNA estraneo nelle cellule. Le cellule transfettate stabilmente passano il DNA estraneo attraverso la progenie. Perciò, per creare linee cellulari transfettate stabilmente, il DNA estraneo deve essere integrato nel genoma della linea cellulare. Tuttavia, l'ereditarietà stabile può essere osservata anche nel DNA non genomico. Una trasfezione efficace e stabile richiede metodi efficaci di consegna del DNA e metodi di selezione per il DNA estraneo all'interno della linea cellulare. Le linee cellulari trasfettate stabilmente vengono utilizzate per una vasta gamma di applicazioni come la produzione di proteine ​​ricombinanti, studi di funzionalità genica, analisi di scoperta di farmaci, ecc..

Aree chiave coperte

1. Come rendere stabile la linea cellulare trasfettata
      - Protocollo di generazione della linea cellulare stabile
2. Come selezionare il DNA trasfettato nella linea cellulare
     - Selezione della linea cellulare trasfettata stabilmente

Termini chiave: manutenzione periodica, integrazione nel genoma, plasmidi, selezione, linee cellulari trasfettate stabilmente

Come rendere stabile la linea cellulare trasfettata

La trasfezione è un metodo di trasferimento genico in cui il materiale genetico è deliberatamente introdotto nella cellula ospite mediante metodi chimici o non chimici. Esistono due tipi di linee cellulari transfettate stabilmente:

1. Il principale tipo di linee cellulari stabili è generato dall'integrazione diretta del DNA transfettato nel genoma dell'organismo ospite. Il DNA transfettato è integrato nel genoma mediante ricombinazione omologa.
2. L'altro metodo per generare linee cellulari stabili è il mantenimento episodico del DNA trasfettato. I vettori eucariotici sono utilizzati nella trasfezione del DNA che non sono integrati nel genoma. Tuttavia, la stabilità del DNA episomale è bassa. Inoltre, gli episodi sono mantenuti solo da alcuni tipi di specie. Le linee cellulari trasfettate stabilmente sono mostrate in Figura 1.

Figura 1: linee cellulari trasfettate in modo stabile

Processi

I passaggi coinvolti nella generazione di linee cellulari stabili sono descritti di seguito.

1. Generazione di una curva di uccisione che determina la concentrazione ottimale di antibiotici di selezione - Le cellule sono sottoposte a quantità crescenti di concentrazione di antibiotici per determinare la concentrazione minima di antibiotici richiesta per uccidere tutte le cellule nell'arco di una settimana.
2. Trasfezione delle cellule con il costrutto plasmidico desiderato - Il metodo di trasfezione differisce dal tipo di cellule ospite. I reagenti liposomiali sono utilizzati nella trasfezione di linee cellulari aderenti. L'elettrotrasfettazione o i metodi virali sono usati per trasfettare le linee cellulari di sospensione.
3. Seleziona ed espandi colonie policlonali stabili - Alle 48-72 ore di transfezione, alle colture vengono aggiunte alte, ottimali e basse concentrazioni di antibiotici selettivi per ottenere linee cellulari transfettate stabilmente.

Come selezionare il DNA trasfettato in linee cellulari

I marcatori di selezione sono co-espressi con il DNA transfettato per la selezione di cellule trasfettate con successo. Il gene marcatore potrebbe essere nello stesso vettore (cis) utilizzato per trasfettare la cellula ospite o su un altro vettore (trans). La resistenza agli antibiotici come neomicina, zeocina, igromicina, puromicina, DHFR, ecc. Può essere utilizzata nella selezione. Inoltre, i geni transfettati possono essere taggati con GFP.

Conclusione

Le linee cellulari stabili possono essere fatte principalmente integrando il DNA transfettato nel genoma. Inoltre, il mantenimento episomico del DNA trasfettato può anche essere usato per creare linee cellulari stabili per un lungo periodo di tempo in alcuni organismi ospiti. Un metodo di selezione dovrebbe essere lì per l'identificazione del DNA transfettato nella linea cellulare. 

Riferimento:

1. "Protocollo di generazione della linea cellulare stabile". BioMart creativo, Disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Knockout mouse production 2" di Kjaergaard - Opera propria (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia