Come realizzare i primer per la PCR

I primer sono una componente essenziale nell'amplificazione del DNA entrambi in vivo e in vitro. In vivo, l'enzima, DNA polimerasi richiede un primer per l'inizio della replicazione del DNA. In vitro, i primer sono principalmente usati per l'inizio della reazione a catena della polimerasi (PCR). Alcune altre tecniche, tra cui sequenziamento, clonazione, mutagenesi sito-diretta, ecc. Richiedono primer. Quindi, la progettazione di primer per in vitro le tecniche diventano abbastanza semplici ma, un processo impegnativo per i biologi molecolari. Pertanto, le regole di base per la progettazione di primer per PCR e sequenziamento sono discusse in questo articolo.

Aree chiave coperte

1. Cos'è un Primer
- Definizione, tipi, ruolo
2. Come funzionano i primer in una PCR
- Caratteristiche del DNA, processo di PCR
3. Come realizzare i primer per la PCR
- Regole di base per progettare i primer PCR
4. Come progettare un Primer Sequencing
- Caratteristiche dei primer sequenziali

Termini chiave: sintesi del DNA, primer diretti, lunghezza, temperatura di fusione, PCR, primer inversi, primer di sequenziamento

Cos'è un Primer

Un primer è un breve filamento di DNA o RNA che funge da punto di partenza per la sintesi del DNA. Gli enzimi che catalizzano la replicazione del DNA sono in grado di aggiungere nucleotidi ad una estremità 3 'esistente. Quindi, il primer pone le basi per la sintesi del DNA servendo come un primo. Primer di RNA sono utilizzati all'interno della cellula per l'inizio della replicazione del DNA mediante DNA polimerasi. Tuttavia, sintetico Primer del DNA può essere utilizzato per l'amplificazione del DNA, principalmente mediante PCR e altre tecniche. Nella PCR vengono utilizzati due tipi di primer e sono noti come primer forward e reverse. Durante la PCR, possono essere prodotte milioni di copie del frammento di DNA desiderato affiancando quella particolare sequenza di DNA nel DNA genomico con primer diretti e inversi. In avanti e all'indietro primer che fiancheggiano una particolare sequenza di DNA sono mostrati in Figura 1.

Figura 1: Primer diretti e inversi

Come funzionano i primer nella PCR

Il DNA è una molecola che ha due filamenti tenuti insieme. Il modello di coppia base è complementare a ciascuno in entrambi i trefoli. I due filamenti sono tenuti insieme dai legami di idrogeno tra basi di azoto complementari. Inoltre, ogni filo ha la propria direzionalità. Un filamento ha direzionalità 5'to 3 'mentre l'altro ha direzionalità 3' a 5 '. Quindi, i due filoni sono antiparalleli. Il filo con la direzione da 5 'a 3' è noto come il filo di senso mentre il filo con la direzione da 3 'a 5' è noto come il filo antisenso. Ogni due fili dovrebbero essere sintetizzati individualmente durante la PCR.

Le tre fasi della PCR sono denaturazione, ricottura e allungamento. Nella denaturazione, i due filamenti di DNA vengono separati rompendo i legami idrogeno riscaldando a 95 ° C. Il primer diretto si lega al filo sensibile mentre il primer inverso si lega al filo antisenso. La ricottura dei primer si verifica quando la temperatura scende da 95 ° C a 50-60 ° C. Quindi, entrambi i filamenti possono essere sintetizzati allo stesso tempo con l'aiuto di Taq polimerasi. L'amplificazione di entrambi i sensi e i fili antisenso si verificano nella direzione da 5 'a 3'. Poiché la PCR è una reazione esponenziale, i tre passaggi vengono ripetuti in 25-35 cicli. Entrambi i primer avanti e indietro vengono utilizzati in ogni ciclo per produrre circa 2³⁵ copie del frammento di DNA desiderato. Il ruolo dei primer nella PCR è mostrato in figura 2.

Figura 2: PCR

Come realizzare i primer per la PCR

Al fine di amplificare un particolare frammento di DNA nel genoma, quel particolare frammento di DNA dovrebbe essere affiancato da entrambi i primer avanti e indietro. Quindi, entrambi i primer dovrebbero essere complementari alle sequenze che fiancheggiano il frammento di DNA. Di seguito sono descritte le linee guida di base per il successo della progettazione dei primer per PCR.

La direzione di entrambi i primer avanti e indietro dovrebbe essere da 5 'a 3'.
La lunghezza di ciascun primer deve essere compresa tra 18 e 25 nucleotidi in lunghezza.
Il contenuto di GC dei primer è compreso tra il 40 e il 60% e la presenza di una C o G nel 3'end del primer può promuovere l'associazione.
La temperatura di fusione e Tm (la temperatura alla quale metà del primer si è ricotto sulla dima) della coppia di primer devono essere simili e superiori a 60 ° C. La differenza massima dovrebbe essere 5 ° C.
L'estremità 3 'del primer deve corrispondere esattamente al DNA del modello.
Almeno basi 2G o C (morsetto GC) dovrebbero essere presenti nelle ultime 5 basi all'estremità 3 'del primer. Il morsetto GC promuove un forte legame alla sequenza bersaglio.
Siti di restrizione con 5-6 nucleotidi possono essere aggiunti al 5'end del primer.
Le ripetizioni dinucleotidiche (ATATATAT) o le ripetizioni dello stesso nucleotide più di 4 volte (ACCCC) devono essere evitate nelle sequenze di primer. Ciò causa l'errore di sottoscrizione.
L'omologia di Intra-Primer o le strutture secondarie dei primer dovrebbero essere evitate. L'omologia tra i primer o le sequenze complementari nei primer forward e reverse devono essere evitate. Entrambe le condizioni possono formare auto-dimeri o primer-dimeri.
Il valore ΔG per l'analisi del dimero deve essere compreso tra 0 e -9 kcal / mole.

Sono disponibili molti strumenti online per la facilità del design del primer come Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, ecc. La specificità dei primer progettati può essere determinata dagli strumenti come NCBI Primer-BLAST o UCSC in-silico PCR.

Figura 3: Interfaccia di Primer 3

Come progettare un Primer Sequencing

I primer di sequenziamento sono brevi, filamenti di DNA, proprio come i primer per PCR. Tuttavia, i primer per PCR sono progettati per l'amplificazione di un particolare frammento di DNA mentre i primer di sequenziamento sono usati per rivelare la sequenza nucleotidica del frammento di DNA amplificato mediante PCR. A differenza dei primer PCR, nel sequenziamento può essere utilizzato un primer singolo, se solo la sequenza target è inferiore a 500 bp di lunghezza. Ad esempio, il primer forward della PCR può essere utilizzato nel sequenziamento, per amplificare solo il senso. Inoltre, il grado di disallineamento tollerato durante la reazione di sequenziamento è superiore alla PCR. Generalmente, i primer per PCR sono complementari alla sequenza target. Tuttavia, alcuni primer di sequenziamento non sono correlati alla sequenza di destinazione. Sono conosciuti come primer universali. Primer universali come T7 o SP6 riconducono al vettore che trasporta la sequenza bersaglio. Possono essere usati sia per una varietà di vettori che per vari tipi di frammenti di DNA.

Conclusione

I primer sono utilizzati nella PCR e nel sequenziamento per l'inizio della sintesi del DNA. Due tipi di primer per PCR possono essere identificati come primer forward e reverse. I primer diretti si ricoprono sul filo sensibile mentre i primer inversi si annettono sul filo antisenso. Nel sequenziamento, è possibile utilizzare il primer in avanti o all'indietro per amplificare il bersaglio. Durante la progettazione dei primer, devono essere considerati molti fattori come la lunghezza dell'iniettore, la Tm e il contenuto di GC. Sono disponibili molti strumenti online che possono essere utilizzati per la progettazione di primer per una particolare sequenza.

Riferimento:

1. "Primer Design: suggerimenti per un processo efficiente." Genome Compiler Corporation, 3 nov. 2015, disponibile qui.
2. "Primer di sequenziamento e progettazione di primer." Primer di sequenziamento e progettazione di primer, Università di Calgary, disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Primers RevComp" di Zephyris - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Polymerase chain reaction" di Enzoklop - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia

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