Come progettare i primer per la mutagenesi diretta del sito
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La mutagenesi sito-diretta (SDM) è un in vitro metodo di creazione di una mutazione in una sequenza nota. Viene spesso eseguito con metodi basati sulla PCR. Tipicamente, una o due basi sono cambiate in mutagenesi sito-diretta. I primer possono essere progettati con le mutazioni desiderate per introdurre piccole modifiche alla sequenza nucleotidica. L'estensione del primer e la PCR inversa possono essere utilizzate per introdurre mutazioni su larga scala. Questo approccio può cambiare la composizione aminoacidica di una particolare proteina. La mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per studiare i cambiamenti dell'attività delle proteine. Viene anche usato per creare proteine di fusione.
Aree chiave coperte
1. Cos'è la mutagenesi diretta dal sito (SDM)
- Definizione, ruolo, metodo
2. Come progettare i primer per la mutagenesi sito-diretta
- Sostituzioni, cancellazioni, inserzioni
Termini chiave: cancellazioni, inserzioni, mutazioni, mutagenesi sito-diretta, sostituzioni, PCR tradizionale
Cos'è la mutagenesi diretta dal sito
La mutagenesi sito-diretta è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per introdurre cambiamenti specifici in una sequenza nucleotidica di un gene. È usato per cambiare la sequenza di aminoacidi di una proteina, introdurre o rimuovere i siti di restrizione, distruggere i siti di legame della trascrizione e creare proteine di fusione.
Processi
Durante la mutagenesi sito-diretta, le mutazioni vengono introdotte nei plasmidi usando primer, costituiti dalla mutazione desiderata. L'intero modello è amplificato dalla PCR, incorporando la mutazione nel modello. Quindi, il modello principale viene rimosso dal campione con l'uso di un enzima, endonucleasi dipendente dalla metilazione. Il prodotto PCR o la molecola plasmidica intaccata con la mutazione desiderata viene trasformata in batteri. I plasmidi possono essere isolati dai batteri con le modifiche desiderate. Il processo di mutagenesi sito-diretta è mostrato in Figura 1.
Figura 1: Mutagenesi diretta dal sito
Tre principali tipi di metodi sono usati per introdurre mutazioni desiderate nella mutagenesi sito-diretta. Si tratta di PCR tradizionale, estensione di primer e PCR inversa. L'estensione del primer e la PCR inversa possono essere utilizzate per introdurre cambiamenti di nucleotidi su larga scala.
PCR tradizionale
La PCR tradizionale può essere utilizzata per introdurre uno o due cambiamenti di nucleotidi nella sequenza target con primer modificati. Le modifiche possono essere sostituzioni nucleotidiche, delezioni o aggiunte. La mutazione è incorporata nell'amplicone durante la PCR. Quindi, la sequenza originale viene sostituita dalla sequenza mutata nel primer.
Primer Extension
Nell'estensione del primer, la mutazione desiderata viene incorporata durante una PCR nidificata. Qui, la sequenza bersaglio è fiancheggiata da due primer. La mutazione desiderata è incorporata nel primer interno e la mutazione viene introdotta nel secondo round PCR. Generalmente, la specificità di una reazione di PCR diminuisce con l'aumento del numero di nucleotidi non corrispondenti nei primer. Tuttavia, i primer interni lunghi con mutazioni su larga scala possono essere utilizzati nell'estensione del primer poiché la PCR nidificata può aumentare la specificità della reazione PCR.
PCR inversa
La PCR inversa è un metodo per amplificare frammenti di DNA sconosciuti progettando primer su una sequenza di DNA nota. Può essere usato per sostituire, eliminare o inserire nucleotidi su larga scala.
Le applicazioni della mutagenesi sito-diretta sono descritte di seguito.
- Studiare la struttura, la funzione e le proprietà catalitiche delle proteine
- Migliorare le proprietà delle proteine (ingegneria delle proteine)
- Per introdurre o rimuovere siti di endonucleasi di restrizione.
Come progettare i primer per la mutagenesi sito-diretta
La mutagenesi sito-diretta è un processo di introduzione della mutazione desiderata per mezzo di un primer. La mutazione può essere una sostituzione, inserimento o cancellazione. Poiché la specificità della PCR diminuisce con l'aumento dei nucleotidi non corrispondenti nel primer, la PCR tradizionale può solo introdurre una o due modifiche della coppia di basi nella sequenza bersaglio. Altri metodi come l'estensione del primer e la PCR inversa possono essere utilizzati per introdurre mutazioni su larga scala. Il disegno del primer nella mutagenesi sito-diretta è mostrato in figura 2.
Figura 2: primer per la mutagenesi diretta dal sito
Sostituzione
Per le sostituzioni, uno dei due primer dovrebbe contenere la mutazione desiderata nel mezzo del primer. Qui, il sito che contiene la mutazione non si annulla alla sequenza bersaglio poiché forma una distorsione.
cancellazione
Per le eliminazioni, la sequenza da eliminare dal target può essere trascurata durante la progettazione del primer. Poiché questa sequenza si trova separata dalla regione fiancheggiata dai primer, non sarebbe amplificata durante la PCR.
Inserimento
Per gli inserimenti, la sequenza da aggiungere è impigliata all'estremità 5 'di uno dei primer durante la progettazione del primer. Pertanto, la sequenza inserita può rimanere attaccata anche all'amplicon.
Conclusione
La mutagenesi sito-diretta è una tecnica utilizzata per introdurre le mutazioni in una sequenza di DNA. Queste mutazioni possono essere sostituzioni, inserzioni o delezioni. Mutazioni su piccola scala possono essere introdotte nella PCR tradizionale. Le mutazioni su larga scala possono essere introdotte nell'estensione del primer o nella PCR inversa. L'introduzione della mutazione avviene mediante l'incorporazione della mutazione desiderata al primer.
Riferimento:
1. "Metodi per la mutagenesi sito-diretta". TECNOLOGIE DI DNA INTEGRATE, Disponibile qui.
Cortesia dell'immagine:
1. "Mutagenesi diretta del sito" di Knbusby - Opera privata (dominio pubblico) tramite Commons Wikimedia
