Come progettare i primer per QPCR

La PCR quantitativa o in tempo reale viene utilizzata come analisi di routine per monitorare i relativi cambiamenti nell'espressione genica in diverse condizioni sperimentali. La progettazione di primer e sonde durante il QPCR è uno dei fattori più cruciali che influenzano la qualità e il successo del test. Diverse linee guida sono applicabili per la progettazione di primer per QPCR: il contenuto di GC dei primer dovrebbe essere del 35-65%; la temperatura di fusione dei primer deve essere compresa tra 60 e 68 ° C; si dovrebbero anche evitare le strutture secondarie, le ripetizioni di Gs o C che sono più lunghe di 3 basi e la formazione di primer-dimeri.

Aree chiave coperte

1. Cos'è QPCR
      - Definizione, processo, usi
2. Come progettare i primer per QPCR
     - Linee guida per il Primer Design per QPCR

Termini chiave: coloranti fluorescenti, contenuto GC, temperatura di fusione, primer, PCR quantitativo (QPCR)

Cos'è QPCR

QPCR è un tipo di PCR che consente la quantificazione del prodotto in tempo reale. Coloranti fluorescenti possono essere utilizzati nella quantificazione dei prodotti PCR etichettandoli in ciascuna fase. È possibile utilizzare due metodi di etichettatura fluorescente nei saggi QPCR. Sono l'uso di coloranti fluorescenti e sonde fluorescenti. I coloranti fluorescenti si legano al prodotto della PCR mentre le sonde si ricoprono con il prodotto PCR per formare un DNA triplex stabile. Il colorante fluorescente ampiamente utilizzato in QPCCR è SYBR Green mentre le sonde possono essere Taqman. L'uso di sonde nel rilevamento di prodotti per PCR durante QPCR fornisce risultati più precisi e aumenta la sensibilità del test.

Figura 1: meccanismo di QPCR

Come progettare i primer per QPCR

La progettazione di primer per QPCR è fondamentale per aumentare l'affidabilità, la precisione e la sensibilità del test. Le linee guida per la progettazione dei primer QPCR sono descritte di seguito.

1. Prodotto PCR / Dimensione amplicone - Le dimensioni del prodotto PCR devono essere di 50-210 coppie di basi.
2. Lunghezza del primer - La lunghezza dei primer deve essere di 19-23 nucleotidi.
3. Contenuto GC - Il contenuto GC dei primer deve essere del 35-65%.
4. Temperatura di fusione (Tm) - La temperatura di fusione dei primer deve essere di 60-68 ° C. La temperatura di annealing per il dosaggio è 5 ° C inferiore alla Tm dei primer.
5. Giunzione esone-esone - Quando amplifichi il cDNA mediante QPCR, i primer dovrebbero estendersi attraverso la giunzione esone-esone per evitare l'amplificazione del DNA contaminante.
6. Ripetizioni e corse - Le ripetizioni dinucleotidiche (TCTCTCTCTC) e nucleotidi ripetuti (ad esempio TAAAAAAAGC) devono essere evitati.
7. 3 'Complementarità - Le regioni complementari delle estremità 3' di primer forward e reverse devono essere evitate per prevenire la formazione di primer-dimeri.
8. 3 'Stabilità - I residui G o C dovrebbero essere inclusi all'estremità 3' del primer per aumentare la stabilità del ricottura.
9. GC clamp - Uno o due morsetti GC all'estremità 5 'del primer aumentano la specificità della ricottura.
10. Specificità - La specificità dei primer deve essere verificata da BLAST
11. SNP - I primer non devono contenere variazioni SNP (single nucleotide polymorphism) note

Diversi strumenti online possono essere utilizzati nel design di primer in QPCR come Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank e OAT.

Figura 2: Formazione di primer-dimeri

I primer devono essere progettati in modo tale da evitare la formazione di primer-dimeri in QPCR. È fondamentale quando si usano coloranti fluorescenti per il rilevamento del prodotto PCR poiché questi coloranti si legano anche con i primer-dimeri per dare risultati falsi positivi.

Conclusione

QPCR è utilizzato per il rilevamento e la quantificazione dei prodotti PCR. La progettazione di primer è fondamentale in QPCR per aumentare la precisione dei risultati. Pertanto è importante seguire attentamente le linee guida nella progettazione di primer per QPCR.

Riferimento:

1. "QPCR Assay Design and Optimization." LSR | Bio-Rad, disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

 

1. "Taqman" per utente: Braindamaged - Opera propria dell'uploader originale (dominio pubblico) tramite Commons Wikimedia
2. "Primer dimers formation En" di Tzachi Bar - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia