Come calcolare l'efficienza della trasfezione

L'efficienza di trasfezione può essere calcolata contando il numero di cellule trasfettate sulle cellule totali in un particolare campione. Il numero di celle può essere contato con due metodi. Il metodo più utilizzato è quello di utilizzare segnalatori facilmente rintracciabili. Questi reporter possono essere proteine ​​di fluorescenza verde (GFP), luciferasi, beta-galattosidasi, secrezione di fosfatasi alcalina (SEAP). Il metodo più recente per calcolare l'efficienza della trasfezione è quello di etichettare gli acidi nucleici, consentendo il rilevamento della loro distribuzione intracellulare. Alcuni altri approcci come il western blotting, l'immunocolorazione e i test funzionali possono anche essere utilizzati per calcolare l'efficienza della trasfezione. Poiché l'efficienza della trasfezione dipende da più parametri sperimentali, la determinazione dell'efficienza di trasfezione è la chiave per determinare l'influenza di vari fattori sulla trasfezione.

Aree chiave coperte

1. Quali sono i metodi utilizzati per calcolare l'efficienza di trasfezione
     - Sistemi Reporter
2. Come calcolare l'efficienza della trasfezione
     - Conteggio delle cellule

Termini chiave: citometria a flusso, GFP, etichettatura degli acidi nucleici, sistema di reporter, efficienza di trasfezione

Quali sono i metodi utilizzati per calcolare l'efficienza di trasfezione

Per calcolare l'efficienza della trasfezione vengono utilizzati diversi tipi di metodi.

1. Sistemi Reporter

- Proteina di fluorescenza verde (GFP) - La GFP si trova naturalmente nelle meduse. Viene utilizzato per l'analisi qualitativa e quantitativa di cellule trasfettate mediante trasfezione simultanea del gene GFP con il gene di interesse. L'analisi qualitativa può essere eseguita con un microscopio a fluorescenza. L'analisi quantitativa può essere eseguita mediante citometria a flusso. Oltre a GFP, anche la proteina di fluorescenza rossa (RFP) e la proteina di fluorescenza gialla (YFP) possono essere utilizzate come reporter. E. coli sono mostrate colonie che esprimono proteine ​​fluorescenti Figura 1.

Figura 1: proteine ​​fluorescenti

• luciferasi - La luciferasi si trova naturalmente nelle lucciole, generando luce. I test di luciferasi sono altamente sensibili e possono essere utilizzati per l'analisi quantitativa del DNA trasfettato.
• Beta-galattosidasi - La beta-galattosidasi si trova in E. coli. Viene utilizzato nell'analisi qualitativa eseguita con X-gal e l'analisi quantitativa eseguita con metodi colorimetrici, fluorescenti o chemiluminescenti.
• Fosfatasi alcalina secretata (PAES) - SEAP è un reporter termostabile, che viene secreto dalle cellule dei mammiferi quando espresso.

2. Etichettatura degli acidi nucleici - I plasmidi marcati con fluorescenza possono essere utilizzati nella trasfezione. Quindi possono essere contati con un microscopio a fluorescenza.

3. Western blotting, immunocolorazione e altri test funzionali

Come calcolare l'efficienza della trasfezione

Il numero di celle che mostrano il reporter e il numero di celle che non esibiscono il reporter possono essere contate al microscopio o mediante citometria a flusso. La percentuale di celle che mostrano il reporter fornisce l'efficienza della trasfezione.

Figura 2: efficienza di trasfezione

Conclusione

L'efficienza di trasfezione può essere calcolata determinando il numero di cellule che mostrano DNA trasfettato sul numero totale di cellule nel campione. Il numero di cellule può essere calcolato al microscopio o mediante citometria a flusso utilizzando un sistema di reporter.

Riferimento:

1. "Misura l'efficienza della trasfezione". Mirus Bio LLC, Disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "E. coli che esprime proteine ​​fluorescenti "Di Erin Rod - Opera propria, (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia