Come funziona il sequenziamento del DNA

Il sequenziamento è il processo implicato nella determinazione di una sequenza nucleotidica di un particolare frammento di DNA. Durante il sequenziamento, il frammento di DNA è marcato terminalmente con nucleotidi marcati con fluorescenza mediante PCR. Questo processo utilizza quattro tipi di nucleotidi marcati con fluorescenza e sono dideossinucleotidi (ddNTP). I ddNTP mancano di un gruppo 3 'OH a cui è collegato il gruppo fosfato del nucleotide entrante. Pertanto, quando un ddNTP viene aggiunto alla catena in crescita, non vi saranno ulteriori aggiunte di nucleotidi all'estremità 3 'della catena. Ciò significa che l'aggiunta di un ddNTP nella catena in crescita termina la crescita della catena. Poiché i ddNTP vengono aggiunti alla miscela PCR a basse concentrazioni, ciascuna catena in crescita viene terminata a diversi livelli. La fluorescenza emittente viene rilevata per determinare la sequenza nucleotidica del frammento di DNA alla fine della PCR.

Aree chiave coperte

1. Cos'è il sequenziamento del DNA
     - Definizione, Tipi
2. Come funziona il sequenziamento del DNA
     - Processo di sequenziamento del DNA

Termini chiave: Dideoxynucleotides (ddNTPs), marcatore fluorescente, elettroforesi su gel, sequenziamento di prossima generazione, sequenza nucleotidica, PCR, sequenziamento di Sanger

Cos'è il sequenziamento del DNA 

Il sequenziamento del DNA è una tecnica di laboratorio utilizzata nella determinazione della sequenza nucleotidica di una particolare molecola di DNA. Utilizza nucleotidi marcati con fluorescenza, che sono incorporati durante la PCR. Esistono due metodi principali di sequenziamento basati sulle tecniche utilizzate nel rilevamento della fluorescenza: sequenziamento di Sanger e sequenziamento di prossima generazione.

Sequenziamento di Sanger

Il sequenziamento di Sanger, sviluppato da Fredric Sanger nel 1975, è il primo metodo di sequenziamento sviluppato. È anche conosciuto come metodo di terminazione della catena da è coinvolto nell'incorporazione selettiva di ddNTPs che terminano la catena durante in vitro Sintesi del DNA Nel sequenziamento di Sanger, gli ampliconi sono separati mediante elettroforesi su gel. Il sequenziamento di Sanger è ampiamente utilizzato per la determinazione della sequenza dei frammenti di DNA utilizzati nella clonazione e dei frammenti amplificati mediante PCR. Viene mostrata una determinata sequenza di DNA Figura 1.

Figura 1: Sequenziamento del DNA

Sequenza di prossima generazione

Le più recenti tecnologie di sequenziamento del DNA sono noti collettivamente come sequenziamento di prossima generazione. È anche un metodo di terminazione della catena. Il sequenziamento di nuova generazione utilizza l'elettroforesi capillare per la separazione di ampliconi con varie lunghezze create con il metodo di terminazione della catena. Il sequenziamento di nuova generazione viene utilizzato nella determinazione di un gran numero di nucleotidi per analisi, come nel sequenziamento del genoma.

Come funziona il sequenziamento del DNA

Durante il sequenziamento del DNA, i nucleotidi marcati con fluorescenza vengono aggiunti a un particolare frammento di DNA mediante PCR. Per l'allungamento del filamento di DNA, vengono utilizzati deossinucleotidi regolari (dNTP). Tuttavia, i ddNTP vengono aggiunti alla miscela di reazione, che è marcata con fluorescenza. Dal momento che i ddNTP non hanno un gruppo 3 'OH nella molecola di zucchero desossiribosio, non si può verificare un'ulteriore crescita della catena, terminando la crescita della catena. Backbone zucchero-fosfato del DNA è formato dalla formazione di legami fosfodiestere tra il gruppo 3 'OH dello zucchero desossiribosio e il gruppo fosfato del nucleotide entrante. Tuttavia, i ddNTP vengono aggiunti a basse concentrazioni; quindi, non terminano la crescita della catena in una sola volta.

Quattro tipi di ddNTP vengono aggiunti a quattro miscele PCR separate. Quattro reazioni PCR separate vengono eseguite aggiungendo ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP. Pertanto, in ciascuna miscela di reazione, la crescita della catena termina con i nucleotidi A, G, C e T, rispettivamente. Ad esempio, nella miscela di reazione con ddATP aggiunto, la crescita di diversi ampliconi termina a ciascun nucleotide A nel frammento di DNA. La determinazione della sequenza del DNA mediante sequenziamento di Sanger è mostrata in figura 2.

Figura 2: Sequenziamento di Sanger

Ciascuno dei quattro tipi di nucleotidi è etichettato con un colore separato, fluorescente; il ddATP è etichettato con colorante verde; il ddGTP è etichettato con colorante giallo; il ddCTP è etichettato con il blu; il ddTTP è etichettato con colorante rosso. Quindi, gli ampliconi delle quattro reazioni PCR sono etichettati in colori separati.

Dopo l'amplificazione del frammento di DNA interessato, gli ampliconi vengono separati mediante elettroforesi su gel o elettroforesi capillare. La sequenza nucleotidica del frammento di DNA può essere determinata dal rilevamento della fluorescenza emittente. La sequenza nucleotidica di 750-1000 frammenti lunghi di coppie di basi può essere facilmente determinata per sequenza mediante il sequenziamento di Sanger. Tuttavia, la determinazione della sequenza nucleotidica di un intero genoma rimane sfidabile a causa di un gran numero di nucleotidi nei genomi. Tuttavia, le tecniche di sequenziamento di prossima generazione come il sequenziamento 454, circa 20 milioni di coppie di basi possono essere lette per singola corsa.

Conclusione

Il sequenziamento del DNA è una tecnica di biologia molecolare utilizzata nella determinazione della sequenza nucleotidica di frammenti di DNA. Durante il sequenziamento, i nucleotidi marcati con fluorescenza vengono aggiunti ai frammenti di DNA mediante PCR. Rilevando la fluorescenza emittente, la sequenza nucleotidica può essere determinata.

Riferimento:

1. "Sequenziamento del DNA". Khan Academy, Disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Sequenza del DNA" di Sjef - Opera propria, di dominio pubblico) via Commons Wikimedia
2. "Didesoxy-Methode" di Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia