Differenza tra sonda e primer

Differenza principale - Sonda vs Primer

La PCR è una tecnica utilizzata nelle biotecnologie per amplificare specifici frammenti di DNA per vari scopi. Sonda e primer sono due tipi di oligonucleotidi a filamento singolo usati in vari tipi di PCR. Le sonde vengono utilizzate principalmente in qPCR mentre i primer sintetici sono utilizzati in ogni tipo di PCR. Il differenza principale tra sonda e primer quella sonda è quella sonda viene utilizzata per rilevare la presenza di uno specifico frammento di DNA nella miscela attraverso l'ibridazione con un DNA a doppia elica mentre il primer viene utilizzato nell'iniziazione della reazione a catena della polimerasi mediante ibridazione con DNA a filamento singolo. Generalmente, i primer sono utilizzati per l'inizio della replicazione del DNA all'interno della cellula. Le sonde vengono utilizzate anche nelle reazioni di ibridazione.

Aree chiave coperte

1. Cos'è una sonda
     - Definizione, design, importanza
2. Cos'è un Primer
     - Definizione, design, importanza
3. Quali sono le somiglianze tra sonda e primer
    - Profilo delle caratteristiche comuni
4. Qual è la differenza tra sonda e primer
   - Confronto tra le principali differenze

Termini chiave: ibridazione, oligonucleotidi, PCR, primer, sonda, QPCR

Cos'è una sonda

La sonda è un frammento di DNA o RNA utilizzato per rilevare la presenza di uno specifico frammento di DNA all'interno di un campione. Pertanto, le sonde possono essere utilizzate per due tipi di tecniche, in qPCR e nelle reazioni di ibridazione. Quattro fatti dovrebbero essere considerati nella progettazione di una sonda.

1. Posizione - Le sonde dovrebbero ibridarsi con il filo del DNA in stretta prossimità del primer inverso o in avanti. Tuttavia, non dovrebbe sovrapporsi ai siti di collegamento dei primer. In generale, le sonde si ibridano con entrambi i filamenti del duplex del DNA.
2. Temperatura di fusione (Tm) - La temperatura di fusione della sonda deve essere superiore di 6-8 ° C rispetto a quella dei primer.
3. Temperatura di annealing (Ta) - La temperatura di annealing dell'esperimento dovrebbe essere 5 ° C al di sotto della temperatura di fusione dei primer.
4. Contenuto GC - Il contenuto del GC della sonda deve essere del 35-65%. L'estremità 5 'della sonda non dovrebbe contenere un G.

In qPCR, le sonde sono etichettate con coloranti fluorescenti o elementi radioattivi. Queste sonde sono ibridate con la sequenza bersaglio nel duplex del DNA. Diversi tipi di sonde etichettate, sia con elementi radioattivi che con fluorescenza, sono usati anche in vari tipi di reazioni di ibridazione. L'ibridazione delle sonde PNA alle loro sequenze target è mostrata in Figura 1. Le sonde PNA sono utilizzate per determinare la lunghezza dei telomeri.

Figura 1: Ibridazione delle sonde PNA

Durante l'ibridizzazione, le sonde si legano al DNA a filamento singolo in modo complementare. 

Cos'è un Primer

Il primer si riferisce a un breve filamento di DNA o RNA che funge da punto di partenza della sintesi del DNA. Primer di RNA vengono utilizzati all'interno della cellula per iniziare la replicazione del DNA con l'aiuto della DNA polimerasi. I primer del DNA sintetico sono utilizzati principalmente nella PCR per amplificare il frammento di DNA desiderato. La sequenza bersaglio è affiancata da due primer noti come primer diretto e primer inverso. Specificità e complementarità sono i fattori principali nella progettazione di primer. Anche le strutture secondarie dovrebbero essere evitate. Altri fattori che dovrebbero essere considerati durante la progettazione dei primer sono descritti di seguito.

1. Temperatura di fusione (Tm) - La temperatura di fusione ottimale di entrambi i primer avanti e retromarcia dovrebbe essere 60-64 ° C.
2. Temperatura di ricottura - La temperatura di annealing dell'esperimento dovrebbe essere 5 ° C al di sotto della temperatura di fusione di ciascun primer.
3. Contenuto GC - Il contenuto di GC dei primer deve essere del 35-65%.

La ricottura del primer avanti e indietro ai due filamenti del DNA bersaglio è mostrata in figura 2.

Figura 2: Ricottura del primer

Nel sequenziamento del DNA, i primer sono utilizzati nell'amplificazione del frammento bersaglio. I primer possono essere etichettati con elementi radioattivi o fluorescenza per vari scopi di rilevamento. 

Somiglianze tra sonda e primer

• Sonda e primer sono due tipi di oligonucleotidi a filamento singolo utilizzati in varie tecniche di PCR per ibridarsi con DNA complementare.
• Sia la sonda che il primer sono specifici per un particolare frammento di DNA.
• Sia la sonda che il primer possono essere DNA / RNA.
• Entrambe le sonde e il primer hanno temperature specifiche da annulare con la sequenza target.
• Sia la sonda che il primer possono essere impigliati con un fluoroforo per il rilevamento.

Differenza tra sonda e primer

Definizione

Sonda: La sonda è un frammento di DNA o RNA utilizzato per rilevare la presenza di uno specifico frammento di DNA all'interno di un campione.

Primer: Il primer è un breve filamento di DNA o RNA che funge da punto di partenza per la sintesi del DNA.

Ruolo

Sonda: Le sonde vengono utilizzate per rilevare uno specifico frammento di DNA in qPCR.

Primer: I primer sono usati per iniziare la replicazione del DNA. Viene anche utilizzato per l'avvio della PCR.

Lunghezza

Sonda: La lunghezza di una sonda può variare da 25-1000 coppie di basi.

Primer: La lunghezza di un primer può variare da 18-22 paia di basi.

ibridazione

Sonda: Le sonde sono ibridate con DNA a doppio filamento.

Primer: I primer sono ibridati con DNA a filamento singolo.

etichettatura

Sonda: Le sonde sono generalmente etichettate con un fluoroforo per il rilevamento.

Primer: I primer possono essere etichettati in base allo scopo.

Conclusione

Sonda e primer sono due tipi di oligonucleotidi a filamento singolo utilizzati in vari tipi di PCR. Le sonde vengono utilizzate nella rilevazione di specifici frammenti di DNA in qPCR. I primer vengono utilizzati per iniziare la replicazione del DNA all'interno della cellula e vengono anche utilizzati per l'avvio della PCR. Pertanto, la principale differenza tra sonda e primer è il loro scopo.

Riferimento:

1. Progettazione di primer e sonde per PCR, Tecnologie DNA integrate, disponibili qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Flusso di lavoro Q-FISH" di Jclam su Wikipedia inglese (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Primers RevComp Allungamento" di Richard Wheeler (Zephyris) - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia