Differenza tra PCR e RT PCR

Differenza principale - PCR vs RT-PCR

PCR e RT-PCR sono due importanti tecniche in biologia molecolare. PCR è stato sviluppato da Kary Mullis negli anni '80. È in grado di aumentare il numero di copie di un particolare gene in modo esponenziale, facilitando la rilevazione di quel particolare frammento di DNA. Taq La polimerasi è l'enzima utilizzato più frequentemente nei sistemi PCR. È un enzima termostabile. In RT-PCR, la trascrizione inversa è seguita dalla PCR. L'enzima, trascrittasi inversa è coinvolto nella sintesi del DNA complementare dall'RNA. Il differenza principale tra PCR e RT-PCR è quello La PCR usa DNA a doppio filamento come modello mentre RT-PCR utilizza l'RNA come modello.

Aree chiave coperte

1. Cos'è la PCR
      - Definizione, processo, applicazione
2. Cos'è la RT PCR
      - Definizione, caratteristiche, applicazione
3. Qual è la differenza tra PCR e RT PCR
      - Confronto tra le principali differenze

Termini chiave: PCR, RT-PCR, reazione a catena della polimerasi, reazione a catena inversa di trascrizione-polimerasi, modello di DNA, DNA polimerasi, denaturazione, ricottura, estensione del primer

Cos'è la PCR

PCR (Reazione a catena della polimerasi) è un metodo relativamente semplice ma rivoluzionario. La PCR utilizza la capacità dell'enzima, DNA polimerasi di sintetizzare nuovi filamenti di DNA in modo complementare rispetto al filamento del modello offerto. La PCR è una tecnica indispensabile utilizzata nei laboratori clinici e di ricerca per l'analisi funzionale dei geni, la diagnosi e il monitoraggio delle malattie ereditarie, la clonazione del DNA, il sequenziamento e l'antica amplificazione del DNA. Modello di DNA, nucleotidi, primer e DNA polimerasi sono i quattro componenti principali della PCR. Il Modello di DNA di solito è un DNA a doppio filamento con la sequenza bersaglio, che deve essere amplificata. Taq DNA polimerasi da cui è isolato Aquatics di Thermus è comunemente usato in PCR. Il Pfu DNA polimerasi è un altro tipo di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Tutti e due Taq e Pfu le polimerasi sono resistenti al calore. I nucleotidi aggiunti dalle DNA polimerasi sono adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). Poiché la DNA polimerasi può solo aggiungere un nuovo nucleotide all'estremità 3 'di un filamento di DNA preesistente, è necessario un primer oligonucleotidico per l'inizio della sintesi del DNA. Il requisito di un primer in PCR consente di delineare solo una regione specifica nel modello. La sequenza bersaglio è affiancata da primer forward e reverse. Alla fine di una PCR, le nuove copie chiamate ampliconi di una specifica sequenza di DNA si accumulano in miliardi. I componenti della PCR dovrebbero essere ottimizzati in modo tale da migliorare le prestazioni della PCR riducendo al minimo il fallimento.

La PCR è un processo automatizzato fatto da termociclatori, che sono in grado di passare da diverse temperature. La PCR è un processo in tre fasi.

Denaturazione - Il modello di DNA a doppio filamento è separato in due singoli filamenti riscaldando a 94-95 ° C.
ricottura - I primer forward e reverse si legano alle sequenze complementari nel modello. La temperatura di questo gradino dipende dalla temperatura di fusione della combinazione di primer.
Estensione del primer - L'enzima DNA polimerasi estende ciascuno dei primer a 3'end aggiungendo basi complementari al filamento in crescita. La temperatura ottimale di Taq polimerasi, 72 ° C viene utilizzata come temperatura nella fase di estensione. Il tempo dell'estensione dipende dal numero di coppie di basi nel modello.

I tre passaggi vengono ripetuti per 28-35 volte.

Figura 1: reazione a catena della polimerasi

I prodotti della PCR hanno dimensioni frazionate mediante elettroforesi su gel di agarosio in confronto con una scala di DNA. La visualizzazione del DNA su un gel di agarosio viene effettuata colorando con bromuro di etidio e osservando sotto UV. Le bande di DNA amplificate sotto UV in un gel colorato con bromuro di etidio sono mostrate in figura 2. La scala del DNA è mostrata nel pozzo più a sinistra.

Figura 2: bande di DNA

Cos'è la RT-PCR

RT-PCR (Reazione a catena della trascrizione-polimerizzazione inversa) è una delle tecniche più sensibili utilizzate per il rilevamento dell'mRNA. L'RNA è il modello appropriato per la raccolta di informazioni sull'espressione genica di un tessuto normale o sull'espressione genica di un tessuto infetto. Il modello per la RT-PCR può essere rispettivamente RNA totale o RNA virale o batterico. L'RNA viene retrotrascritto in DNA complementare (cDNA) dall'enzima, trascrittasi inversa. La temperatura ottimale della trascrittasi inversa è di 46 ° C. Il cDNA è utilizzato in PCR per ottenere il prodotto. I passaggi nella PCR di trascrizione inversa sono mostrati in figura 3.

Figura 3: RT-PCR

La RT-PCR può essere eseguita in reazioni in due fasi o in una fase. Nella reazione in due fasi, la trascrizione inversa e la PCR vengono eseguite in due passaggi separati. Nella RT-PCR one-step, la trascrizione inversa è seguita dalla PCR in una singola provetta in modo sequenziale. Entrambi i prodotti cDNA e PCR finale possono essere eseguiti su un gel di agarosio per scopi di visualizzazione e di dimensioni. La RT-PCR di uno stadio e due fasi sono mostrate in figura 4.

Figura 4: RT-PCR one-step e two-step

Differenza tra PCR e RT-PCR

Definizione

PCR: La PCR è una tecnica utilizzata in biologia molecolare per amplificare un segmento di DNA che genera milioni di copie di una sequenza di DNA.

RT-PCR: RT-PCR è una variante della PCR utilizzata nella rilevazione dell'espressione genica in biologia molecolare.

passi

PCR: La denaturazione, la ricottura e l'estensione sono i tre passaggi della PCR.

RT-PCR: In RT-PCR, la trascrizione inversa è seguita dalla PCR.

Modello

PCR: Una molecola di DNA a doppio filamento funge da modello per la PCR.

RT-PCR: Una molecola di RNA a filamento singolo funge da modello per la trascrizione inversa. Una molecola di DNA a singolo filamento funge da modello per la PCR.

Enzimi usati

PCR: La DNA polimerasi viene usata come enzima nella PCR.

RT-PCR: Trascrittasi inversa e DNA polimerasi vengono utilizzate come enzimi in RT-PCR.

primer

PCR: I primer forward e reverse sono usati nella PCR.

RT-PCR: Per la trascrizione inversa viene utilizzato solo il primer inverso e nella PCR vengono utilizzati primer sia avanti che indietro.

sensibilità

PCR: La PCR è un metodo sensibile.

RT-PCR: RT-PCR è più sensibile alla PCR.

applicazioni

PCR: La PCR è utilizzata nell'analisi funzionale di geni, diagnosi e monitoraggio di malattie ereditarie, clonazione del DNA, sequenziamento del DNA e amplificazione del DNA antico.

RT-PCR: RT-PCR è utilizzato nella rilevazione dell'espressione genica.

Conclusione

PCR e RT-PCR sono due le tecniche importanti utilizzate nella biologia molecolare. Sia la PCR che la RT-PCR sono tecniche automatizzate in grado di aumentare esponenzialmente il numero di copie di una sequenza di DNA bersaglio, definita dai primer forward e reverse. Nella PCR, il DNA a doppio filamento viene utilizzato come modello. Tramite PCR, è possibile eseguire la clonazione del DNA, il sequenziamento del DNA e l'analisi funzionale dei geni. Nella RT-PCR, l'espressione genica in un particolare tessuto può essere osservata amplificando l'RNA. La principale differenza tra PCR e RT-PCR è nei modelli utilizzati in ciascuna reazione e nelle loro applicazioni.

Riferimento:

1. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n. Web. Disponibile qui. 01 giugno 2017.
2. "Polymerase Chain Reaction (o PCR)." Clonazione e analisi molecolare dei geni. N., n. Web. Disponibile qui. 01 giugno 2017.
3. Biolabs, New England. "Sintesi CDNA e RT-PCR." Sintesi CDNA e RT-PCR | NEB. N., n. Web. Disponibile qui. 01 giugno 2017.

Cortesia dell'immagine:

1. "Polymerase chain reaction" di Enzoklop - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Di Rainis Venta - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Reazione a catena polimerica di trascrizione inversa" di Jpark623 - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. "One-step vs two-step RT-PCR" di Jpark623 - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia

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