Differenza tra PCR e QPCR

Differenza principale - PCR vs QPCR

PCR (polymerase chain reaction) e qPCR (quantitative PCR) sono due tecniche utilizzate in biotecnologia per amplificare il DNA per vari scopi. La PCR è una tecnica relativamente semplice. qPCR è anche conosciuto come PCR in tempo reale o PCR digitale. Il differenza principale tra PCR e qPCR è quello La PCR è una tecnica qualitativa mentre qPCR è una tecnica quantitativa. PCR consente di leggere il risultato come "presenza o assenza". Ma in qPCR, la quantità di DNA amplificata in ogni ciclo è quantificata. Se l'RNA è usato nella PCR, la tecnica è nota come RT-PCR (reverse transcription PCR), e se l'RNA è usato in qPCR, la tecnica è nota come qRT-PC.

Aree chiave coperte

1. Cos'è la PCR
- Definizione, processi, usi
2. Cos'è QPCR
- Definizione, processi, usi
3. Quali sono le somiglianze tra PCR e QPCR
- Profilo delle caratteristiche comuni
4. Qual è la differenza tra PCR e QPCR
- Confronto tra le principali differenze

Termini chiave: elettroforesi su gel di agarosio, ampliconi, DNA polimerasi, colorante fluorescente, PCR, sonde, qPCR, RT-qPCR

Cos'è la PCR

La PCR si riferisce a una tecnica in biotecnologia che consente l'analisi di una breve sequenza di DNA amplificando un segmento selezionato di DNA. È relativamente un metodo sensibile poiché i volumi molto piccoli sono richiesti da una singola reazione. La tecnica si basa sulla capacità della DNA polimerasi di sintetizzare nuovi filamenti di DNA sul modello proposto, in modo complementare. La miscela di reazione di PCR è composta da DNA polimerasi, nucleotidi di DNA, primer, il modello di DNA da amplificare e magnesio. L'amplificazione viene eseguita all'interno di un termociclatore. La DNA polimerasi dovrebbe essere resistente al calore poiché in questa reazione vengono utilizzate alte temperature. I due tipi di DNA polimerasi usati nella PCR sono Taq DNA polimerasi e Pfu DNA polimerasi. Taq La DNA polimerasi è ampiamente utilizzata nella PCR.

La DNA polimerasi richiede un filamento di DNA preesistente all'estremità 3 'per sintetizzare un nuovo filamento. Quindi, un primer oligonucleotidico viene aggiunto alla miscela di reazione per l'inizio della sintesi del DNA. Il requisito di un primer in PCR consente l'amplificazione di una regione specifica nel modello. La sequenza bersaglio è affiancata da primer forward e reverse. Alla fine di una PCR, nuove copie di una sequenza specifica di DNA, che sono chiamate ampliconi, sono accumulati in miliardi. I componenti della PCR dovrebbero essere ottimizzati in modo tale da migliorare le prestazioni della PCR riducendo al minimo il fallimento. La reazione PCR standard è mostrata in Figura 1.

Figura 1: PCR

Passi di PCR

Di seguito sono descritti i tre passaggi di una PCR.

Denaturazione - Il modello di DNA a doppio filamento è separato in due singoli filamenti riscaldando a 94-95 ° C.
ricottura - I primer forward e reverse si legano alle sequenze complementari nel modello. La temperatura dipende dalla temperatura di fusione della combinazione di primer.
Estensione del primer - L'enzima DNA polimerasi estende ogni primer al loro 3'end aggiungendo basi complementari al filamento in crescita. La temperatura ottimale di Taq la polimerasi, cioè 72 ° C, viene usata come temperatura nella fase di estensione. Il tempo dell'estensione dipende dal numero di coppie di basi nel modello.

I tre passaggi vengono ripetuti per 28-35 volte. L'elettroforesi su gel di agarosio viene utilizzata nel frazionamento delle dimensioni dei prodotti PCR. Il prodotto è colorato con bromuro di etidio ed è osservato sotto i raggi UV. Il prodotto PCR o il DNA amplificato può essere utilizzato nella clonazione, sequenziamento o genotipizzazione.

Cos'è QPCR

QPCR fa riferimento a una tecnica in biotecnologia che consente il rilevamento, la caratterizzazione e la quantificazione degli acidi nucleici per varie applicazioni. Quindi, è un tipo di PCR quantitativa. Sia il DNA che l'RNA possono essere usati come qPCR. Se l'RNA è usato come modello, dovrebbe essere dapprima trascritto in senso inverso nel cDNA. Pertanto, questo tipo di qPCR è noto come RT-qPCR. La PCR tradizionale viene eseguita per cDNA o campione di DNA abituale. Tuttavia, in qPCR, i coloranti fluorescenti vengono utilizzati per etichettare il prodotto PCR in ogni fase del ciclo PCR. Ciò consente la raccolta di dati mentre la PCR progredisce, consentendo la quantificazione degli ampliconi durante la fase esponenziale della PCR. Il principale tipo di tintura utilizzato in qPCR è SYBR Green. Il colorante si lega al DNA a doppio filamento. Poiché la fluorescenza aumenta proporzionalmente alla quantità di DNA amplificato, la quantificazione può essere eseguita in "tempo reale". Lo svantaggio principale dell'uso del colorante è che consente la quantificazione di un prodotto specifico nel campione. Oltre ai coloranti, le sonde possono essere utilizzate anche nel processo di quantificazione. Le sonde TaqMan sono uno dei principali tipi di sonde oligonucleotidiche utilizzate in qPCR e il processo di emissione di fluorescenza è mostrato in figura 2.

Figura 2: sonda TaqMan

Le sonde possono essere progettate in modo tale da rilevare diversi prodotti PCR all'interno dello stesso campione. La sonda TaqMan è uno dei principali tipi di sonde per idrolisi; l'incorporazione di questa sonda nel prodotto PCR espone il fluoroforo, emettendo la fluorescenza. I coloranti fluorescenti sono più specifici del prodotto PCR. Quindi, vengono utilizzati nella maggior parte dei test diagnostici per rilevare il prodotto PCR.

Somiglianze tra PCR e QPCR

PCR e qPCR sono due tipi di tecniche utilizzate nelle biotecnologie per amplificare il DNA per vari scopi.
La tradizionale reazione a catena della polimerasi viene eseguita come tecnica di base sia in PCR che in qPCR.
L'RNA può essere utilizzato sia in PCR che in qPCR utilizzando la trascrizione inversa come prima reazione.

Differenza tra PCR e QPCR

Definizione

PCR: La PCR è una tecnica in biotecnologia che consente l'analisi di una breve sequenza di DNA amplificando un segmento selezionato di DNA.

QPCR: QPCR è una tecnica in biotecnologia che consente il rilevamento, la caratterizzazione e la quantificazione di acidi nucleici per varie applicazioni.

Quantitativo qualitativo

PCR: La PCR è una tecnica qualitativa.

QPCR: QPCR è una tecnica quantitativa.

Rilevazione del prodotto

PCR: Il prodotto viene rilevato dall'elettroforesi su gel di agarosio in PCR.

QPCR: Il prodotto può essere rilevato in ogni ciclo di amplificazione in qPCR.

Raccolta di dati

PCR: I dati vengono raccolti alla fine della reazione in PCR.

QPCR: I dati vengono raccolti durante la fase esponenziale della reazione in qPCR.

Risoluzione

PCR: PCR ha una risoluzione molto scarsa.

QPCR: QPCR ha una risoluzione molto alta.

coloranti

PCR: PCR utilizza bromuro di etidio per colorare il prodotto durante la PCR.

QPCR: QPCR utilizza coloranti fluorescenti per rilevare il prodotto.

Tempo

PCR: La PCR è un metodo che richiede più tempo.

QPCR: QPCR richiede meno tempo.

RNA

PCR: RT-PCR è il tipo di PCR che utilizza l'RNA come modello.

QPCR: RT-qPCR è il tipo di qPCR che utilizza l'RNA come modello.

Ruolo

PCR: La PCR viene utilizzata per rilevare la presenza o l'assenza di alcuni frammenti genomici.

QPCR: QPCR viene utilizzato per quantificare un particolare frammento in un campione.

Conclusione

PCR e qPCR sono due tipi di tecniche utilizzate nelle biotecnologie per amplificare il DNA per vari scopi. La PCR è il metodo di amplificazione tradizionale usato per identificare la presenza o l'assenza di un frammento di DNA. QPCR viene utilizzato per quantificare un particolare frammento in un campione. Pertanto, la PCR è una tecnica qualitativa mentre qPCR è una tecnica quantitativa. Questa è la principale differenza tra PCR e qPCR.

Riferimento:

1. "QPCR vs. Digital PCR vs. Traditional PCR." Thermo Fisher Scientific, Disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "PCR" di Madprime - Opera propria (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Taqman" per utente: Braindamaged - Opera propria dell'uploader originale (dominio pubblico) tramite Commons Wikimedia

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