Differenza tra estrazione di DNA e RNA
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Il differenza principale tra l'estrazione del DNA e dell'RNA è il livello di pH di L'estrazione del DNA è a pH 8 mentre il livello di pH dell'estrazione dell'RNA è pH 4,7. Il DNA tende a denaturare e passare alla fase organica a pH acido. A pH alcalino, l'RNA subisce l'idrolisi alcalina a causa della presenza di 2 'OH nello zucchero ribosio.
L'estrazione del DNA e dell'RNA sono le due procedure coinvolte nell'isolamento e nella purificazione degli acidi nucleici dalle cellule dei tessuti. Entrambe le procedure consistono in tre passaggi. DNA e RNA di buona qualità svolgono un ruolo fondamentale negli esperimenti di biologia molecolare, biotecnologia, genomica ed epidemiologia.
Aree chiave coperte
1. Cos'è l'estrazione del DNA
- Definizione, procedura
2. Cos'è l'estrazione dell'RNA
- Definizione, procedura
3. Quali sono le somiglianze tra l'estrazione di DNA e di RNA
- Profilo delle caratteristiche comuni
4. Qual è la differenza tra l'estrazione del DNA e dell'RNA
- Confronto tra le principali differenze
Termini chiave: lisi cellulare, denaturazione delle proteine, estrazione del DNA, pH, precipitazione, estrazione dell'RNA
Cos'è l'estrazione del DNA
L'estrazione del DNA è la procedura di isolamento e purificazione del DNA. Il DNA può essere isolato da sangue, campioni di tessuto congelato o blocchi di tessuto di paraffina. Le tre fasi dell'estrazione del DNA sono la lisi cellulare, l'isolamento del DNA e la precipitazione. Durante la lisi cellulare, le barriere della membrana cellulare come la membrana cellulare e le membrane del nucleo si rompono per esporre il DNA. Il passo successivo è la rimozione dei lipidi di membrana dal campione. Infine, la precipitazione del DNA comporta la rimozione delle proteine associate al DNA dalla proteasi e la rimozione dell'RNA da parte di RNasi.
Figura 1: Procedura di estrazione del DNA
Protocolli di base dell'estrazione del DNA
Di seguito sono riportati i protocolli di base dell'estrazione del DNA.
1. Lisi cellulare con il tampone di lisi cellulare per lisare le membrane cellulari
2. I lipidi sono suddivisi con detergenti e tensioattivi
3. Digestione di proteine aggiungendo proteasi
4. Digestione di RNA aggiungendo RNasi
5. Separazione di detriti cellulari, proteine digerite, lipidi e RNA aggiungendo sale concentrato seguito da centrifugazione
6. Precipitazione di etanolo del DNA con etanolo freddo o isopropanolo. La forza ionica dell'acetato di sodio può essere utilizzata per migliorare la precipitazione. Il DNA precipitato appare come fili nella soluzione finale.
Figura 2: DNA estratto
L'estrazione fenolo-cloroformio può anche essere utilizzata per separare il DNA dalle proteine. Qui, il fenolo denatura le proteine nel campione e il DNA rimane nella fase acquosa alla fine dell'estrazione. E, nella fase organica, puoi trovare le proteine denaturate. Un altro metodo per estrarre il DNA è la purificazione minicolonna. Qui, il legame del DNA nella colonna dipende dal pH e dalla concentrazione salina del tampone.
Cos'è l'estrazione dell'RNA
L'estrazione dell'RNA si riferisce al processo di purificazione dell'RNA dai campioni. Il metodo convenzionale di estrazione dell'RNA è chiamato il estrazione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio. Il tiocianato di guanidinio denatura le proteine. Inoltre, interrompe il legame idrogeno delle molecole d'acqua e funge da agente caotropico. Un reagente speciale viene utilizzato nell'estrazione dell'RNA chiamato Tri-reagente. Contiene tiocianato di guanidinio, fenolo e acetato di sodio. Lo scopo dei passaggi fondamentali dell'estrazione dell'RNA è simile a quello dell'estrazione del DNA. Il protocollo per l'estrazione dell'RNA è descritto di seguito.
1. Le cellule vengono lavate con PBS ghiacciato per mantenere l'osmolarità delle cellule.
2. Aspirare le cellule e omogeneizzare il campione con Tri-reagent.
3. Aggiungi cloroformio e agita.
4. La centrifugazione può comportare tre strati. Lo strato superiore è lo strato acquoso, che è chiaro. Lo strato intermedio o l'interfase contiene il DNA precipitato. Lo strato inferiore è lo strato organico, che è rosa.
5. Rimuovere lo strato acquoso e aggiungere isopropanolo. La centrifugazione può causare un pellet.
6. Lavare il pellet con etanolo al 75%. Asciugare all'aria il pellet.
7. Sciogliere il pellet con tampone TE o acqua.
Figura 3: estrazione fenolo-cloroformio di RNA
L'estrazione dell'RNA è generalmente effettuata a pH inferiore a 7. A pH alcalino, l'RNA è più soggetto ad essere degradato dall'idrolisi alcalina a causa della presenza di un gruppo OH in posizione 2 'dello zucchero ribosio. Inoltre, l'RNA tende a rimanere nella fase acquosa a pH acido. D'altra parte, il DNA tende a denaturare e passare alla fase organica a pH acido. Pertanto, l'estrazione del DNA può essere effettuata a circa pH 8. Il DNA è costituito da zucchero desossiribosio e non subisce l'idrolisi alcalina.
Somiglianze tra estrazione di DNA e RNA
- L'estrazione del DNA e dell'RNA sono le procedure implicate nell'isolamento e nella purificazione degli acidi nucleici da campioni biologici.
- Entrambe le procedure implicano la lisi cellulare, la purificazione degli acidi nucleici dai detriti e le proteine associate e la preparazione degli estratti.
- Per entrambe le procedure, è necessario mantenere tutte le condizioni di freddo.
- Coinvolge la centrifugazione nella separazione dei componenti nella miscela.
- Necessità di inattivare l'attività degli enzimi nucleasi durante entrambe le procedure.
- L'estrazione fenolo-cloroformio è uno dei passaggi critici di entrambi i tipi di estrazioni.
- Il tiocianato di guanidinio può essere usato per proteggere gli acidi nucleici.
- La precipitazione dell'RNA può essere effettuata con isopropanolo.
- La forza ionica dell'acetato di sodio viene utilizzata per migliorare la precipitazione degli acidi nucleici.
- I campioni possono essere quantificati misurando il diametro esterno a 260 nm.
Differenza tra estrazione di DNA e RNA
Definizione
Estrazione del DNA: Procedura di isolamento e purificazione del DNA
Estrazione dell'RNA: Processo di purificazione dell'RNA dai campioni
Tipo di acido nucleico estratto
Estrazione del DNA: DNA
Estrazione dell'RNA: RNA
pH
Estrazione del DNA: Fatto a 8
Estrazione dell'RNA: Fatto a 4.7
passi
Estrazione del DNA: Rompere le membrane cellulari o la lisi cellulare, rimuovere i lipidi della membrana e precipitare il DNA
Estrazione dell'RNA: Lisi cellulare, estrazione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio, preparazione con isopropanolo
Uso di acqua trattata con DEPC
Estrazione del DNA: Nessuna
Estrazione dell'RNA: Tutti i reagenti sono preparati con acqua trattata con DEPC
Conservazione
Estrazione del DNA: Il DNA può essere estratto prima e conservato in lotti
Estrazione dell'RNA: L'estrazione dell'RNA avviene appena prima delle procedure a valle
Archiviazione a lungo termine
Estrazione del DNA: A -20 ° C
Estrazione dell'RNA: A -80 ° C
Conclusione
L'estrazione del DNA viene effettuata a pH 8. Il DNA tende a spostarsi verso la fase organica in quanto denatura a pH acido. Ma l'estrazione dell'RNA viene effettuata a pH basso per prevenire la degradazione da idrolisi alcalina. Lo scopo di base dei passaggi dell'estrazione del DNA e dell'RNA è simile. La principale differenza tra l'estrazione del DNA e dell'RNA è il pH utilizzato in ogni tipo di estrazione.
Riferimento:
1. "Le basi dell'estrazione del DNA". Libro di testo virtuale Alaska BioPREP, Alaska BioPREP Università dell'Alaska Fairbanks, disponibile qui
2. "RNA Isolation and Reverse Transcription Protocol: Cells in Culture". Abcam, disponibile qui
Cortesia dell'immagine:
1. "Figure 17 01 02" di CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2. "DNA Extraction" di Joo Nath - Opera propria (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
3. "Estrazione di PhOH-CHCl3" di Squidonius (parla) - Opera propria (Testo originale: self-made) (Dominio pubblico) via Commons Wikimedia
