Differenza tra NGS e Sanger Sequencing

Differenza chiave - NGS vs Sanger Sequencing
 

Next Generation Sequencing (NGS) e Sanger Sequencing sono due tipi di tecniche di sequenziamento nucleotidico sviluppate nel tempo. Il metodo Sanger Sequencing è stato ampiamente utilizzato per molti anni e NGS lo ha sostituito recentemente a causa dei suoi vantaggi. La differenza chiave tra NGS e Sanger Sequencing è quella NGS lavora sul principio di sequenziare milioni di sequenze simultaneamente in modo rapido attraverso un sistema di sequenziamento mentre Sanger Sequencing lavora sul principio della terminazione della catena a causa dell'incorporazione selettiva di dideoxinucleotidi da parte dell'enzima DNA polimerasi durante la replicazione del DNA e conseguente separazione dei frammenti per capillare elettroforesi.

CONTENUTO
1. Panoramica e differenza chiave
2. Cos'è il sequenziamento dei nucleotidi
3. Cos'è NGS
4. Cos'è il sequenziamento di Sanger
5. Confronto affiancato - Sequenza NGS vs Sanger
6. Sommario

Cos'è il sequenziamento dei nucleotidi?

Le informazioni genetiche sono memorizzate nelle sequenze nucleotidiche del DNA o dell'RNA di un organismo. Il processo di determinazione dell'ordine corretto dei nucleotidi (utilizzando quattro basi) in un dato frammento (in un gene, un cluster di geni, cromosoma e genoma completo) è noto come sequenziamento dei nucleotidi. È molto importante negli studi genomici, negli studi forensi, nella virologia, nella sistematica biologica, nella diagnosi medica, nelle biotecnologie e in molti altri campi per analizzare la struttura e la funzione dei geni. Esistono diversi tipi di metodi di sequenziamento sviluppati dagli scienziati. Tra loro, Sequenziamento di Sanger sviluppato da Frederick Sanger nel 1977 è stato ampiamente utilizzato e reso popolare per un lungo periodo di tempo fino al Sequenza di prossima generazione sostituito.

Cos'è NGS?

Next Generation Sequencing (NGS) è un termine usato per riferirsi ai moderni processi di sequenziamento ad alto throughput. Descrive una serie di diverse tecnologie di sequenziamento moderne che hanno rivoluzionato gli studi genomici e la biologia molecolare. Tali tecniche sono il sequenziamento Illumina, il sequenziamento di Roche 454, il sequenziamento di protoni ionici e il sequenziamento SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). I sistemi NGS sono più veloci ed economici. Quattro principali metodi di sequenziamento del DNA sono usati nei sistemi NGS e precisamente; pirosequenziamento, sequenziamento per sintesi, sequenziamento mediante legatura e sequenziamento di ioni semiconduttori. Un gran numero di filamenti di DNA o RNA (milioni di) possono essere sequenziati parallelamente. Permette il sequenziamento dell'intero genoma di organismi in un breve periodo di tempo, a differenza del sequenziamento di Sanger che richiede più tempo.

NGS ha molti vantaggi rispetto al metodo Sanger di sequenziamento convenzionale. È un processo ad alta velocità, più accurato ed economico che può essere eseguito con una piccola dimensione del campione. NGS può essere utilizzato in studi metagenomici, nella rilevazione di variazioni all'interno di un singolo genoma a causa di inserzioni e delezioni ecc. E nell'analisi delle espressioni geniche.

Figura_1: sviluppi nel sequenziamento NGS

Cos'è il sequenziamento di Sanger?

Sanger Sequencing è un metodo di sequenziamento sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi colleghi nel 1977 per determinare l'esatto ordine nucleotidico di un dato frammento di DNA. È anche conosciuto come sequenziamento della terminazione di catena o Sequencing di tipo dideoxy. Il principio di funzionamento di questo metodo è la terminazione della sintesi del filamento mediante incorporazione selettiva di un dideoxinucleotide terminante a catena (ddNTP) come ddGTP, ddCTP, ddATP e ddTTP mediante DNA polimerasi durante la replicazione del DNA. I nucleotidi normali hanno gruppi 3 'OH per la formazione di un legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti per continuare la formazione del filamento. Tuttavia, i ddNTP mancano di questo gruppo 3 'OH e non sono in grado di formare legami fosfodiestere tra nucleotidi. Quindi, l'allungamento della catena è cessato.

In questo metodo, il DNA a filamento singolo da sequenziare funge da modello per il filamento in vitro Sintesi del DNA Altri requisiti sono il primer oligonucleotidico, i precursori deossinucleotidici e l'enzima DNA polimerasi. Quando sono note le estremità fiancheggianti del frammento bersaglio, i primer possono essere facilmente progettati per la replicazione del DNA. Quattro reazioni separate di sintesi del DNA sono eseguite in quattro provette separate. Ogni tubo ha ddNTPs separati, insieme ad altri requisiti. Dal particolare nucleotide, viene aggiunta una miscela di dNTP e ddNTP. Allo stesso modo, quattro reazioni separate vengono eseguite in quattro tubi con quattro miscele. Dopo le reazioni, vengono eseguite la rilevazione di frammenti di DNA e la conversione del pattern di frammenti in informazioni di sequenza. I frammenti di DNA risultanti sono denaturati a caldo e separati mediante elettroforesi su gel. Se vengono utilizzati nucleotidi radioattivi, il pattern di bande nel gel di poliacrilammide può essere visualizzato mediante autoradiografia. Quando questo metodo utilizza i dideossinucleotidi marcati in modo fluorescente, può essere mitigato lungo la lettura del gel e passato attraverso un raggio laser per essere rilevato dal rilevatore fluorescente. Per evitare errori che potrebbero sorgere quando una sequenza viene letta dall'occhio e inserita manualmente in un computer, questo metodo si è sviluppato nell'uso del sequenziatore automatico accoppiato al computer.

Questo è il metodo utilizzato per sequenziare il DNA dal progetto Human Genome. Questo metodo è ancora in uso con modifiche avanzate perché fornisce informazioni di sequenza accurate nonostante sia un processo costoso e lento.

Figura_2: Sequenziamento di Sanger

Qual è la differenza tra NGS e Sanger Sequencing?

Sequenza NGS vs Sanger
Next Generation Sequencing (NGS) si riferisce ai moderni processi di sequenziamento ad alto throughput. Descrive un numero di differenti tecnologie di sequenziamento moderne	Sanger Sequencing è un metodo di sequenziamento sviluppato da Frederick Sanger per determinare l'ordine preciso del nucleotide di un dato frammento di DNA.
Efficacia dei costi
NGS è un processo più economico perché riduce il tempo, la potenza dell'uomo e le sostanze chimiche.	Questo è un processo costoso perché richiede tempo, energia umana e più sostanze chimiche.
Velocità
Questo è più veloce dal momento che sia il rilevamento chimico che il rilevamento del segnale di molti fili avvengono parallelamente.	Questo richiede molto tempo poiché il rilevamento chimico e il rilevamento del segnale avvengono come due processi separati e solo su un filo possono essere letti contemporaneamente.
Affidabilità
NGS è affidabile.	Il sequenziamento di Sanger è meno affidabile
Misura di prova
NGS richiede meno quantità di DNA.	Questo metodo richiede una grande quantità di DNA modello.
Basi del DNA per frammento sequenziato
Il numero di basi del DNA per frammento sequenziato è inferiore al metodo Sanger	La generazione di sequenze è più lunga delle sequenze di NGS.

Riepilogo: NGS vs Sanger Sequencing

NGS e Sanger Sequencing sono tecniche di sequenziamento nucleotidico ampiamente utilizzate in Biologia Molecolare. Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento iniziale che è stato sostituito da NGS. La principale differenza tra NGS e Sanger Sequencing è che NGS è un processo ad alta velocità, più accurato ed economico rispetto al sequenziamento Sanger. Entrambe le tecniche hanno creato importanti epidemie in Genetica e Biotecnologia.

Riferimento:
1. Nowrousian, Minou. "Tecniche di sequenziamento di prossima generazione per microrganismi eucarioti: soluzioni basate sul sequenziamento per problemi biologici." Cellula eucariotica. American Society for Microbiology, settembre 2010. Web. 18 febbraio 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen e A. R. Coulson. "Sequenziamento del DNA con inibitori che terminano la catena." Atti della National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-467. web.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu e Maggie Law. "Confronto tra sistemi di sequenziamento di prossima generazione." Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. web.

Cortesia dell'immagine:
"Sanger-sequencing" di Estevezj - Opera propria (CC BY-SA 3.0) attraverso Commons Wikimedia 
"Sviluppi nel sequenziamento di prossima generazione" Di Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) attraverso Commons Wikimedia