Come isolare l'mRNA dall'RNA totale

Le combinazioni oligo-dT / portatore sono utilizzate principalmente nella purificazione dell'mRNA dall'RNA totale mediante una tecnica nota come cromatografia di affinità. Esistono due metodi principali per isolare l'mRNA dall'RNA totale in base al tipo di cellule; vale a dire, metodo diretto di isolamento di mRNA e metodo meno di isolamento di mRNA. Entrambi i metodi sono spiegati in questo articolo.

L'RNA messaggero (mRNA) è un prodotto di trascrizione, costituito da una serie di nucleotidi di RNA. Trasporta informazioni in geni dal nucleo al citoplasma per la sintesi di proteine. L'isolamento dell'RNA da una particolare linea cellulare porta all'RNA totale, che consiste di rRNA e tRNA insieme agli mRNA. Quindi, l'mRNA deve essere separato dalla miscela di RNA totale durante lo studio del trascrittoma della linea cellulare. Per la separazione vengono utilizzate proprietà uniche dell'mRNA come la presenza di una coda di poli (A) all'estremità 3 'della molecola dell'mRNA. Poiché le molecole di oligo-dT sono complementari alla coda di poli (A), l'mRNA può essere isolato da una miscela di RNA totale.

Aree chiave coperte

1. Cos'è l'mRNA
     - Definizione, struttura, funzione
2. Qual è la composizione di RNA totale
    - mRNA, rRNA, tRNA
3. Come isolare l'mRNA dall'RNA totale
    - Uso di Oligo-dT / Carrier Molecules

Termini chiave: cromatografia di affinità, RNA messaggero (mRNA), metodo meno, Oligo dT, coda Poly (A), RNA totale

Cos'è l'mRNA

L'mRNA è una trascrizione di un gene codificante la proteina. È prodotto all'interno del nucleo negli eucarioti e trasporta informazioni per la produzione di una particolare proteina nel citoplasma. È tradotto in una sequenza aminoacidica della proteina durante la traduzione, assistita da ribosomi. Il trascritto principale prodotto dalla trascrizione degli eucarioti è chiamato pre-mRNA.

Figura 1: Struttura dell'mRNA

Durante le modifiche post-trascrizionali, una molecola matura di mRNA viene prodotta con diverse caratteristiche come la capsula 5 'cap e poly (A). L'mRNA totale di un particolare organismo è noto come trascrittoma.

Qual è la composizione di RNA totale

Il risultato dell'isolamento dell'RNA è chiamato RNA totale. È composto da tutti e tre i principali tipi di RNA prodotti da una cellula. Sono mRNA, tRNA e rRNA. Sia il tRNA che l'rRNA aiutano nella traduzione. La dimensione dell'mRNA eucariotico è 0,5-20 kb. Trasferire l'RNA (tRNA) porta gli aminoacidi corrispondenti durante la traduzione. È lungo 76-90 paia di basi ed è composto da una regione di anticodone, che è complementare ad un particolare codone su mRNA. L'RNA ribosomiale (rRNA) è un componente dei ribosomi. Alcuni degli rRNA umani sono lunghi 5 kb.

Oltre il 90% dell'RNA totale è composto da tRNA e rRNA. Solo l'1-5% dell'RNA totale è l'mRNA. Una tipica cellula di mammifero può essere costituita da circa 500.000 molecole di mRNA per cellula. La quantità di un particolare tipo di mRNA può essere di 15-20.000 copie per cella.

Come isolare l'mRNA dall'RNA totale

Un certo numero di tecniche di biologia molecolare come la costruzione di librerie cDNA, la preparazione del campione per la preparazione di microarray, l'analisi Northern blot per geni debolmente espressi, ecc. Richiedono mRNA di alta qualità. Esistono due metodi principali per isolare l'mRNA dall'RNA totale in base al tipo di cellule: metodo diretto dell'isolamento dell'mRNA e metodo meno dell'isolamento dell'mRNA.

Metodo diretto di isolamento dell'mRNA

Il principio della separazione dell'mRNA maturo dall'RNA totale eucariotico coinvolge la cromatografia di selezione / affinità di affinità dell'mRNA poliadenilato con l'uso di oligo dT (oligodeoxthymidylate), che è complementare alla coda di poli (A). È reso possibile dall'assenza di una coda poli (A) negli altri due tipi di RNA: tRNA e rRNA. 

L'mRNA è costituito da 30-200 nucleotidi di adenina nella sua coda poli (A). Colonne di affinità riempite con oligo dT / combinazione portante vengono utilizzate nell'isolamento dell'mRNA dall'RNA totale. La combinazione oligo dT / carrier può essere oligo dT legata alla cellulosa, oligo dT biotinilato con perline magnetiche accoppiate alla streptavidina o perline in polistirene-lattice accoppiate con oligo dT. Tutte le condizioni sperimentali dovrebbero essere in condizioni RNasi-free per prevenire la rottura enzimatica di RNA.

Figura 2: cromatografia di affinità

L'RNA totale deve essere sciolto in un tampone di sale alto e riscaldato brevemente a 65-70 ° C per interrompere le strutture secondarie di RNA. Le condizioni per l'isolamento dell'RNA variano tra i kit disponibili in commercio per l'isolamento dell'mRNA. Tuttavia, la preparazione di poli (A) -RNA o mRNA è composta da tre passaggi.

1. Ibridazione di molecole poli (A) -RNA in oligo dT collegate a un vettore
2. Lavaggio dell'RNA non legato
3. Eluizione di poli (A) -RNA da combinazione oligo-dT / carrier in condizioni di bassa stringenza

Metodo meno per l'isolamento dell'mRNA

La purificazione dell'mRNA basata sull'oligo dT produce solo mRNA con una coda poli (A) o un mRNA eucariotico maturo. Quindi, un altro metodo noto come metodo meno può essere usato nella purificazione dell'mRNA che non ha una coda di poli (A). Questo metodo può essere utilizzato nell'isolamento dell'mRNA dal lievito e dall'RNA totale batterico. Può anche essere usato nell'isolamento del tipo immaturo di mRNA insieme all'mRNA maturo delle cellule eucariotiche. Coinvolge l'arricchimento del trascrittoma depletando il grande RNA ribosomiale dall'RNA totale. Il RiboMinus^TM Il kit di isolamento del trascrittoma di ThermoFisher Scientific utilizza tre passaggi per l'efficiente purificazione dell'mRNA dal lievito e dall'RNA totale batterico.

1. Ibridazione dell'RNA totale con sonde oligonucleotidiche marcate con biotina da 5 'specifiche per sequenza di rRNA
2. Rimozione del complesso di sonde marcate con rRNA / 5'-biotina insieme con le sfere magnetiche rivestite di streptavidina
3. Purificazione delle impurità e eluizione dell'mRNA.

Conclusione

L'RNA totale è composto dai tre tipi principali di RNA: mRNA, rRNA e tRNA. La purificazione dell'mRNA dall'RNA totale è essenziale per l'analisi del trascrittoma di un particolare organismo. I metodi di purificazione sono basati sul tipo di mRNA. L'mRNA eucariotico, che contiene una coda di poli (A), può essere isolato mediante cromatografia di affinità con oligo dT. L'mRNA eucariotico immaturo e l'mRNA da lievito e cellule batteriche possono essere isolati depletando l'ampio rRNA dall'RNA totale.

Riferimento:

1. "Estrazione di mRNA." Thermo Fisher Scientific, disponibile qui.
2. "RNA Extraction by RNA Type." Thermo Fisher Scientific, disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Mature mRNA" (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Affinità" di Jamit in inglese Wikibooks - Trasferito da en.wikibooks a Commons da Adrignola usando CommonsHelper (dominio pubblico) tramite Commons Wikimedia