Come funziona Southern Blotting

Il Southern blotting è una tecnica utilizzata per il rilevamento di frammenti specifici di DNA all'interno di un campione. La tecnica di blotting coinvolge la separazione di frammenti di DNA in base alle dimensioni tramite elettroforesi su gel, trasferendo il campione di DNA frazionato in una membrana filtrante, ibridando i frammenti di DNA specifici con una sonda specifica per sequenza etichettata e rilevando le bande etichettate.

Oltre all'identificazione di DNA specifico in un campione, le dimensioni e l'abbondanza di un particolare tipo di DNA possono anche essere determinate mediante Southern blotting. Il processo coinvolto nel Southern blotting è descritto in questo articolo.

Aree chiave coperte

1. Cos'è Southern Blot
     - Definizione, principio, applicazioni
2. Come funziona Southern Blotting
     - Processo di Southern Blotting

Termini chiave: DNA, elettroforesi su gel, sonda di ibridazione, membrana di nylon, digestione di restrizione, Southern Blotting

Cos'è Southern Blot

Il Southern blotting è una tecnica di ibridazione utilizzata nell'identificazione di DNA specifico in un campione. La tecnica fu sviluppata per la prima volta da Edward M. Southern nel 1975. Questo processo identifica le sequenze del DNA, le dimensioni e l'abbondanza di una particolare sequenza di DNA all'interno di un campione.

Viene mostrata una membrana per l'asciugatura del sud Figura 1.

Figura 1: Southern Blotting Membrane

Applicazioni del Southern Blotting

Le applicazioni di Southern blotting sono descritte di seguito.

1. Per rilevare un particolare frammento di DNA
2. Per isolare un particolare frammento di DNA
3. Per identificare mutazioni e riarrangiamenti genici
4. Nei saggi RFLP (polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione)
5. Identificare le malattie genetiche
6. Per identificare agenti infettivi
7. Test di paternità
8. Nel fingerprinting del DNA per identificare i criminali

Come funziona Southern Blotting

Il Southern blotting prevede la separazione dei frammenti di DNA in base alle dimensioni tramite elettroforesi su gel, trasferendoli in una membrana, ibridandoli con una sonda specifica per sequenza etichettata e rilevando le bande etichettate. I passaggi di Southern blotting sono descritti di seguito.

1. Digestione del DNA - Il campione di DNA viene digerito dagli enzimi di restrizione per ottenere frammenti di DNA e questi frammenti vengono amplificati mediante PCR.
2. Elettroforesi su gel - I frammenti di DNA sono frazionati per dimensioni mediante elettroforesi su gel.
3. Denaturazione - Il gel con DNA frazionato viene immerso in NaOH o HCl per denaturare il DNA a doppio filamento.
4. assorbente - Frammenti di DNA nel gel vengono trasferiti in una membrana di nylon caricata positivamente mediante un processo chiamato blotting.
5. Cottura e blocco - La carta assorbente con frammenti di DNA viene preparata per fissare il DNA sulla membrana. Quindi, i siti di legame non occupati sono saturi trattando con albumina di siero bovino (BSA) o caseina.
6. Ibridazione con sonde etichettate - La membrana legata al DNA viene trattata con una sonda marcata che contiene una sequenza nucleotidica complementare al frammento di DNA interessato. Le sonde di ibridazione sono generalmente lunghe 100-500 bp e sono etichettate con nucleotidi radioattivi.
7. Visualizzazione per autoradiogramma - La membrana legata alla sonda viene visualizzata sotto autoradiogramma per ottenere i modelli del frammento di DNA interessato.

Figura 2: Southern Blotting

L'intero processo di Southern blotting è mostrato in figura 2.

Conclusione

Il Southern blotting è una tecnica di ibridazione utilizzata per identificare specifiche sequenze di DNA da un campione. In questo processo, il campione di DNA viene frazionato dagli enzimi di restrizione e la miscela viene eseguita su un gel. Quindi, il modello di bande nel gel viene trasferito in una membrana di nylon e ibridato con una sonda etichettata, che consente il rilevamento del frammento interessato.

Riferimento:

1. "Southern Blotting." Thermo Fisher Scientific, Disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Southern blot membrane" di Bojan Žunar - Opera propria (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Figure 17 01 05" di CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia