Come funziona Illumina Sequencing

Il sequenziamento Illumina è un metodo di sequenziamento di prossima generazione, chiamato anche "sequenziamento per sintesi" metodo. Il sequenziamento Illumina è coinvolto nell'elaborazione di milioni di frammenti in parallelo. I quattro passaggi fondamentali coinvolti nel flusso di lavoro di sequenziamento Illumina sono la preparazione delle librerie, la generazione dei cluster, il sequenziamento e l'analisi dei dati, che sono ulteriormente descritti in questo articolo.

Aree chiave coperte

1. Cos'è il sequenziamento Illumina
     - Definizione, fatti, vantaggi
2. Come funziona Illumina Sequencing
     - Processo di Sequenziamento Illumina:
          - Preparazione della biblioteca
          - Cluster Generation
          - sequencing
          - Analisi dei dati

Termini chiave: generazione di cluster, analisi dei dati, sequenziamento Illumina, preparazione della libreria, sequenziamento per sintesi

Cos'è il sequenziamento Illumina

La tecnologia Illumina Sequencing o Sequencing-by-Synthesis (SBS) è la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione più utilizzata al mondo. Oltre il 90% dei dati di sequenziamento del mondo sono generati dal sequenziamento Illumina. È stato originariamente sviluppato da Shankar Balasubramanian e David Klenerman presso l'Università di Cambridge. Fondarono una società nota come Solexa nel 1998. Poi Illumina acquistò Solexa nel 2007, migliorando rapidamente la tecnologia originale. Quindi, viene anche chiamato il metodo Metodo di sequenziamento Solexa / Illumina. Il vantaggio principale del sequenziamento Illumina è che offre un alto rendimento di letture prive di errori.

Come funziona Illumina Sequencing

I quattro passaggi coinvolti nel sequenziamento Illumina sono descritti di seguito.

Passaggio 1. Preparazione della libreria

• Una libreria di sequenziamento viene preparata da simultaneamente tagmentation del DNA in segmenti brevi di 200-600 coppie di basi mediante trasposasi in un processo noto come codifica, seguito da legatura dell'adattatore in entrambe le estremità 3 'e 5' dei segmenti corti del DNA.
• Ulteriori motivi come il sito di legame del primer di sequenziamento, l'indice e una regione, che è complementare all'oligo delle cellule di flusso, vengono aggiunti all'adattatore da entrambi i lati amplificazione a ciclo ridotto. La tagmentazione e l'aggiunta di motivi sono mostrati in Figura 1.

Figura 1: Tagmentazione e aggiunta di motivi

Passaggio 2. Generazione di cluster

• La libreria di sequenziamento preparata viene denaturata e caricata in a cella di flusso per la generazione di cluster. Durante la generazione del cluster, ciascun frammento nella libreria di sequenziamento viene isotermicamente amplificato. La cella di flusso è costituita da vetro contenente corsie. Ogni corsia è rivestita con due tipi di oligonucleotidi. Un tipo è complementare alla regione 5 'dei motivi aggiuntivi e l'altro tipo è complementare alla regione 3' dei motivi aggiuntivi della libreria preparata. Quindi, questi oligo si legano alle corrispondenti regioni del DNA nella libreria di sequenziamento. La cella di flusso con due tipi di oligos è mostrata in figura 2. L'oligo che si lega alla regione 5 'della libreria di sequenziamento è di colore rosa mentre l'oligo che si lega alla regione 3' della libreria di sequenziamento è di colore verde.

Figura 2: cella di flusso

• Una volta che la libreria di sequenziamento a filamento singolo è legata all'oligo, il filamento complementare è generato dalla DNA polimerasi. Quindi, il risultante DNA a doppio filamento viene denaturato e il filo originale viene lavato via.
• Il amplificazione clonale del frammento è realizzato attraverso amplificazione del ponte. Durante questo processo, il filo si piega sul secondo tipo di oligo sulla cella di flusso. Quindi, polimerasi sintetizza il ponte a doppio filamento. La denaturazione del ponte si traduce in due filamenti di DNA: sia in avanti che in senso inverso sull'oligo della cella di flusso.
• L'amplificazione del ponte viene ripetuta più volte per ottenere contemporaneamente milioni di cluster di tutti i tipi di frammenti nella libreria di sequenziamento mediante amplificazione clonale. L'amplificazione clonale è mostrata in figura 3.

Figura 3: amplificazione clonale

• Quindi i fili invertiti vengono lavati via, mantenendo solo i trefoli in avanti sulla cella di flusso. Nella parte anteriore, l'estremità 3 'è libera ed è bloccata per impedire l'innesco indesiderato.

Passaggio 3. Sequenziamento

Prima lettura della sequenza inversa

• Il sequenziamento inizia con estensione del primo iniettore di sequenziamento. Il metodo di sequenziamento Illumina utilizza dNTP modificati, che contengono un terminatore nella posizione 3 'dello zucchero desossissivo. Questi dNTP sono anche etichettati a fluorescenza in diversi colori.

• Dopo l'aggiunta di ciascun nucleotide complementare, i cluster nella cella di flusso vengono osservati per l'emissione di fluorescenza.

• Dopo il rilevamento della luce, il fluoroforo può essere rimosso.

• Quindi il gruppo terminatore della posizione 3 'dello zucchero viene rigenerato da un gruppo idrossile, consentendo l'aggiunta di un secondo dNTP alla catena in crescita. Questo processo è noto come sequenziamento per sintesi. La sequenza per sintesi è mostrata in figura 4.

Figura 4: Sequenza per sintesi

• Al completamento della sintesi, il prima lettura della sequenza inversa viene ottenuto e il prodotto di sequenziamento viene lavato via.

Indice 1 Leggi

• Il primer indice 1 viene quindi ibridato in cluster per generare una seconda lettura allo stesso modo mediante sequenziamento per sintesi. Il prodotto di sequenziamento viene lavato via.

Indice 2 Leggi

• L'estremità 3 'del cluster viene quindi deprotetta, consentendo l'ibridazione dell'estremità 3' con il secondo tipo di oligo sulla cella di flusso (colore verde). Con ciò, si ottiene la sequenza della regione dell'indice 2. Il prodotto di sequenziamento viene lavato via.

Seconda lettura della sequenza in avanti

• Il secondo tipo di oligo è esteso da una polimerasi, formando un ponte a doppio filamento. Il ponte è denaturato e le loro estremità 3 'sono bloccate. Il filo in avanti viene lavato via.
• Il seconda lettura della sequenza in avanti è ottenuto attraverso il sequenziamento per sintesi mediante l'ibridazione e l'estensione del secondo primer di sequenziamento.

Passaggio 4. Analisi dei dati

• I miliardi di letture ottenuti dal sequenziamento sono raggruppati in base alle sequenze di indici.
• Quindi, le sequenze con letture simili sono raggruppate in cluster.
• Le letture forward e reverse sono accoppiate per formare sequenze contigue.
• Gli allineamenti ambigui possono essere risolti mediante sequenze accoppiate.
• Le sequenze contigue sono allineate al genoma di riferimento per l'identificazione della variante.

Il seguente video spiega il processo completo del sequenziamento Illumina.

Conclusione

Il sequenziamento Illumina è un metodo di sequenziamento di prossima generazione. Il sequenziamento Illumina è coinvolto nella preparazione di una libreria di sequenziamento con 200-600 coppie di basi lunghe frammenti di DNA. I quattro passaggi coinvolti nel sequenziamento Illumina sono la preparazione delle librerie, la generazione dei cluster, il sequenziamento e l'analisi dei dati. Poiché il sequenziamento Illumina fornisce letture di sequenza con elevata precisione, è il metodo di sequenziamento ampiamente utilizzato nel mondo.

Riferimento:

1. "Sequencing by Synthesis (SBS) Technology." Tecnologia di sequenziamento | Sequenziamento per sintesi, Disponibile qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Preparazione dell'elaborazione del DNA" di DMLapato - Opera propria (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Catene di oligonucleotidi nella cella a flusso" di DMLapato - Opera propria (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
3. "Sequencing by synthesis Terminatori reversibili" Di Abizar Lakdawalla (parla) - Ho creato questo lavoro interamente da solo (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. "Cluster Generation" di DMLapato - Opera propria (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia