In che modo i marcatori fluorescenti aiutano a determinare una sequenza di nucleotidi

Il sequenziamento del DNA è una tecnica che aiuta a determinare la sequenza nucleotidica di una particolare molecola di DNA. I due metodi di sequenziamento sono il sequenziamento Sanger e il sequenziamento di prossima generazione. Entrambi i tipi di metodi di sequenziamento sono completamente automatizzati. Ogni filamento di DNA è composto dai quattro nucleotidi: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). I nucleotidi nel frammento di DNA sono etichettati con quattro marcatori fluorescenti separati in entrambi i tipi di metodi di sequenziamento. I marcatori fluorescenti o fluorofori sono molecole in grado di assorbire la luce ed emetterla a una lunghezza d'onda ben definita. I marcatori fluorescenti sono incorporati nel filamento del DNA mediante PCR. Quindi la sequenza dei nucleotidi è determinata da tecniche automatizzate.

Aree chiave coperte

1. Cos'è il sequenziamento
     - Definizione, Sequenziamento di Sanger, Sequencing di prossima generazione
2. In che modo i marcatori fluorescenti aiutano a determinare una sequenza di nucleotidi
     - Procedura di sequenziamento

Termini chiave: Dideoxynucleotides (ddNTPs), marcatore fluorescente, elettroforesi su gel, sequenziamento di prossima generazione, sequenza nucleotidica, PCR, sequenziamento di Sanger

Cos'è il sequenziamento

Il sequenziamento è una tecnica di laboratorio utilizzata per determinare la sequenza nucleotidica di una molecola di DNA. Due tipi principali di metodi di sequenziamento del DNA possono essere identificati come sequenziamento Sanger e sequenziamento di prossima generazione. Sia il sequenziamento Sanger che il sequenziamento di nuova generazione utilizzano nucleotidi marcati con fluorescenza per la determinazione della sequenza nucleotidica.

Sequenziamento di Sanger

Il sequenziamento di Sanger è il primo metodo sviluppato per il sequenziamento del DNA. Il metodo di sequenziamento è stato sviluppato per la prima volta da Fredric Sanger nel 1975. Di conseguenza, è noto come sequenziamento Sanger. Il metodo di sequenziamento di Sanger è anche noto come metodo di terminazione della catena poiché è coinvolto nell'incorporazione selettiva di dideoxinucleotidi a catena (ddNTPS) mediante DNA polimerasi durante in vitro Sintesi del DNA L'allungamento del filamento di DNA è ottenuto dai deossinucleotidi regolari (dNTP). Tuttavia, i ddNTP vengono aggiunti alla miscela di reazione per interrompere la crescita della catena. Questi ddNTP sono etichettati a fluorescenza. I quattro tipi di ddNTP sono aggiunti a quattro miscele PCR separate. Pertanto, vengono eseguite quattro reazioni PCR separate aggiungendo ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP. In ciascuna miscela di reazione, la crescita della catena termina a ciascun nucleotide A, G, C e T rispettivamente. Ad esempio, nella miscela di reazione con ddATP aggiunto, la crescita di diversi ampliconi termina a ciascun nucleotide A nel frammento di DNA. Quindi, queste quattro reazioni vengono separate mediante elettroforesi su gel e un fluorometro viene utilizzato per la scansione della fluorescenza separata. Il sequenziamento di Sanger è ampiamente utilizzato per la determinazione della sequenza dei frammenti utilizzati nella clonazione del DNA e dei frammenti amplificati mediante PCR. Le sequenze nucleotidiche determinate sono mostrate in Figura 1.

Figura 1: Sequenze di DNA

Sequenza di prossima generazione

Le più recenti tecnologie di sequenziamento del DNA sono noti collettivamente come sequenziamento di prossima generazione. Le reazioni di sequenziamento sono eseguite in microscala su un chip in una sola volta. Pertanto, diverse reazioni di sequenziamento sono eseguite in parallelo. Nel sequenziamento di nuova generazione, l'elettroforesi capillare viene utilizzata in aggiunta all'elettroforesi su gel per la separazione di amliconi con varie lunghezze create con il metodo di terminazione della catena. L'elettroforesi capillare è un metodo di separazione analitica mediante il quale le molecole vengono separate in base alla loro mobilità elettroforetica.

In che modo i produttori di fluorescenti aiutano a determinare una sequenza di nucleotidi

Durante il sequenziamento, il DNA da sequenziare funge da modello per la sintesi del DNA mediante PCR. Un primer del DNA viene utilizzato per l'inizio della sintesi del DNA mediante DNA polimerasi. Una combinazione di quattro basi regolari (dNTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) e un basso livello di uno dei quattro dideossinucleotidi (ddNTP, ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP) vengono aggiunti come componenti della reazione PCR. Quindi, quattro reazioni individuali di PCR vengono eseguite aggiungendo ciascuna delle quattro ddNTP. I dideossinucleotidi possiedono due caratteristiche speciali:

1. Mancano il gruppo 3'-OH a cui il nucleotide entrante è aggiunto dalla DNA polimerasi. Quindi, l'incorporazione del ddNTP termina la crescita della catena.
2. Sono etichettati con diversi coloranti fluorescenti: il ddATP è etichettato con una tintura verde, il ddGTP è etichettato con un colorante giallo, il ddCTP è etichettato con il blu, e il ddTTP è etichettato con colorante rosso.

Tuttavia, le catene che terminano ddNTPs vengono aggiunte a basse concentrazioni; non terminano l'intero processo PCR in una sola volta. Ma quando uno dei quattro ddNTP viene incorporato nella catena in crescita, quella particolare crescita della catena viene terminata. Perciò, alla fine di ciascuna delle quattro reazioni di PCR, viene prodotta una serie di ampliconi (i frammenti di DNA risultanti mediante PCR), che vengono terminati a ciascun nucleotide del frammento di DNA bersaglio. Questi ampliconi possono essere eseguiti in un gel. I coloranti fluorescenti che passano in un punto definito del gel elettroforetico possono essere scansionati da un fluorometro per determinare la sequenza nucleotidica nei sequenziatori di DNA automatizzati. La sequenza nucleotidica marcata con fluorescenza ottenuta nel sequenziamento del DNA è mostrata in figura 2.

Figura 2: sequenza nucleotidica marcata con fluorescenza

Combinando ciascuno dei nucleotidi nella serie, è possibile determinare la sequenza nucleotidica del frammento di DNA iniziale. La sequenza nucleotidica di un frammento con 750-1000 coppie di basi può essere facilmente determinata per sequenza mediante il sequenziamento di Sanger. Tuttavia, il sequenziamento di un intero genoma rimane ancora sfidabile a causa della presenza di un gran numero di nucleotidi. Il sequenziamento 454 è un tipo di sequenziamento di prossima generazione mediante il quale si possono leggere 20 milioni di coppie di basi per singola corsa.

Conclusione

Il sequenziamento è una tecnica utilizzata nella determinazione della sequenza nucleotidica di un particolare frammento di DNA. Sequenziamento di Sanger e sequenziamento di prossima generazione sono le due principali tecnologie di sequenziamento. Entrambe le tecnologie utilizzano marcatori fluorescenti per la determinazione della sequenza nucleotidica. Ciascuno dei quattro dideossinucleotidi che terminano la catena è etichettato con quattro diversi coloranti fluorescenti e sono utilizzati in quattro reazioni PCR separate per ottenere la sequenza.

Riferimento:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies." Nature News, Nature Publishing Group, disponibile qui.
2. Carr, Steven M. Sequenza fluorescente, disponibile qui.
3. "Sequencing DNA - Sequenziamento automatizzato con coloranti fluorescenti." Articoli JRank, disponibili qui.

Cortesia dell'immagine:

1. "Alineando secuencias (2)" di Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) via Flickr
2. "Seq radioattivo fluorescente" di Abizar su Wikipedia inglese (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia