Differenza tra Northern Southern e Western Blotting

Differenza chiave - Northern vs Southern vs Western Blotting
 

La rilevazione di sequenze specifiche di DNA, RNA e proteine ​​è essenziale per vari tipi di studi in biologia molecolare. L'elettroforesi su gel è una tecnica che separa DNA, RNA e proteine ​​in base alle loro dimensioni. Dai profili di gel, particolari sequenze di DNA, sequenze di RNA o proteine ​​sono rilevate dalle speciali tecniche chiamate blotting e ibridazione con sonde marcate. Esistono tre diversi tipi di metodi di blotting, ovvero southern, northern e western. La differenza chiave tra il sud del nord e il western è il tipo di molecola che rileva da un campione. Il Southern blotting è un metodo che rileva una sequenza specifica di DNA da un campione di DNA. Il Northern blotting è una tecnica che rileva una sequenza specifica di RNA da un campione di RNA. Il western blotting è un metodo che rileva una proteina specifica da un campione di proteine.

CONTENUTO
1. Panoramica e differenza chiave
2. Cos'è Southern Blot
3. Cos'è il Northern Blotting
4. Cos'è il Western Blotting
5. Confronto Side by Side - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Sommario

Cos'è Southern Blot?

La tecnica di Southern blotting è stata sviluppata da E. M. Southern nel 1975 per l'identificazione di una sequenza specifica di DNA da un campione di DNA. Questa è la prima tecnica di blotting introdotta nella biologia molecolare. Permetteva il rilevamento di geni specifici dal DNA, frammenti specifici dal DNA, ecc. Ci sono diversi passaggi coinvolti nella tecnica del Southern Blot. Sono come segue.

1. Il DNA viene isolato dal campione e digerito con endonucleasi di restrizione.
2. Il campione digerito viene separato mediante elettroforesi su gel di agarosio.
3. Frammenti di DNA nel gel sono denaturati in singoli filamenti mediante l'uso di una soluzione alcalina.
4. Il DNA a filamento singolo viene trasferito su una membrana filtrante in nitrocellulosa mediante trasferimento capillare.
5. Il DNA trasferito viene fissato permanentemente sulla membrana.
6. Il DNA fisso sulla membrana è ibridato con sonde etichettate.
7. Il DNA non legato viene lavato via dalla membrana mediante lavaggio.
8. La pellicola a raggi X viene esposta alla membrana e viene preparato un autoradiografo.

Il Southern blotting viene applicato per diversi aspetti della biologia molecolare. È utile nella mappatura RFLP, negli studi forensi, nella metilazione del DNA nell'espressione genica, nel rilevamento di geni mutati in disordini genetici, nel DNA fingerprinting, ecc..

Figura 01: Southern Blotting Technique

Cos'è il Northern Blotting?

Il Northern blotting è un metodo progettato per rilevare una sequenza di RNA specifica o una sequenza di mRNA da un campione per studiare l'espressione genica. Questa tecnica è stata sviluppata da Alwine, Kemp e Stark nel 1979. Si differenzia dalle tecniche di macchiatura occidentale e acida a causa di diversi passaggi. Tuttavia, questa tecnica viene eseguita anche mediante elettroforesi su gel, blotting e ibridazione con sonde e rilevamento specifici. La tecnica di Northern blotting viene eseguita come segue.

1. L'RNA viene estratto dal campione e separato mediante elettroforesi su gel.
2. L'RNA viene trasferito dal gel su una membrana assorbente e fissato.
3. La membrana viene trattata con una sonda marcata preparata da cDNA o RNA (la sonda è complementare a una sequenza specifica nel campione).
4. La sonda viene incubata con la membrana per legarsi con una sequenza specifica.
5. Le sonde non associate vengono lavate via.
6. I frammenti ibridati sono rilevati da un autoradiografo.

Il Northern blotting è uno strumento importante per il rilevamento e la quantificazione dell'mRNA ibridato, studiando la degradazione dell'RNA, la valutazione dell'emivita di RNA, l'individuazione dello splicing dell'RNA, lo studio dell'espressione genica, ecc..

Figura 02: Macchiatura nordica

Cos'è il Western Blotting?

Il western blotting è un metodo per rilevare una specifica proteina da una miscela di proteine ​​mediante l'uso di anticorpi marcati. Pertanto, Western Blot è anche noto come un immunoblot. Questa tecnica è stata introdotta da Towbin et al nel 1979 ed è ora di routine nei laboratori per l'analisi delle proteine. I passaggi sono come segue.

1. Le proteine ​​vengono estratte dal campione
2. Le proteine ​​sono separate dalle loro dimensioni usando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide
3. Le molecole separate vengono trasferite in una membrana PVDF o in una membrana di nitrocellulosa mediante elettroporazione
4. La membrana è bloccata per il legame non specifico con gli anticorpi
5. Le proteine ​​trasferite sono legate con anticorpi primari (anticorpi marcati con l'enzima).
6. La membrana viene lavata per rimuovere gli anticorpi primari legati in modo non specifico
7. Gli anticorpi legati vengono rilevati aggiungendo un substrato e rilevando il precipitato colorato formato

Il western blotting è utile nel rilevamento di anticorpi anti-HIV in un campione di siero umano. Western blot può anche essere usato come test di conferma per l'infezione da epatite B e test definitivo per la mucca pazza.

Figura 03: Western blotting

Qual è la differenza tra Northern Southern e Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Tipo di molecola rilevata
Macchie nordiche	Il Northern blotting rileva una sequenza specifica di RNA da un campione di RNA.
Macchiatura del sud	Il Southern blotting rileva una sequenza specifica di DNA da un campione di DNA.
Macchia occidentale	Il western blotting rileva una proteina specifica da un campione di proteine.
Tipo di gel
Macchie nordiche	Questo utilizza gel Agarose / formaldeide.
Macchiatura del sud	Questo utilizza un gel Agarose.
Macchia occidentale	Questo utilizza il gel di poliacrilammide.
Metodo di blotting
Macchie nordiche	Questo è un trasferimento capillare.
Macchiatura del sud	Questo è un trasferimento capillare.
Macchia occidentale	Questo è un trasferimento elettrico.
Sonde utilizzate
Macchie nordiche	sonde di cDNA o RNA etichettate in modo radioattivo o non radioattivo.
Macchiatura del sud	Le sonde del DNA sono etichettate in modo radioattivo o non radioattivo.
Macchia occidentale	Gli anticorpi primari sono usati come sonde.
Sistema di rilevamento
Macchie nordiche	Questo viene fatto utilizzando un autoradiografo o il rilevamento di luce o cambiamento di colore.
Macchiatura del sud	Questo viene fatto usando un autoradiografo, rilevamento di luce o cambiamento di colore.
Macchia occidentale	Questo viene fatto usando il rilevamento della luce o il cambiamento di colore.

Sommario - Northern vs Southern vs Western Blotting

Il blotting è una tecnica speciale sviluppata per l'identificazione di DNA, RNA o proteine ​​specifici dai campioni. Esistono tre procedure di blotting separate, vale a dire nord, sud e ovest, per rilevare uno specifico tipo di molecola. La tecnica Northern blotting è progettata per rilevare una sequenza specifica di RNA da una miscela di RNA. La tecnica Southern blotting consente il rilevamento di una sequenza specifica di DNA da un campione di DNA e la tecnica di western blotting è sviluppata per identificare una proteina specifica da una miscela di proteine.

Riferimenti
1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Protein Transfer Overview." North American Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, marzo 2014. Web. 27 marzo 2017
2. Brown, T. "Southern blotting." Protocolli attuali in immunologia. U.S. National Library of Medicine, maggio 2001. Web. 27 marzo 2017
3. He, Shan L. "Northern blot." Metodi in enzimologia. Biblioteca nazionale degli Stati Uniti di medicina, 2013. Web. 27 marzo 2017

Cortesia dell'immagine:
1. "Northern Blot Scheme" di RNA405 - Opera propria (dominio pubblico) tramite Commons Wikimedia
2. "Western blot 114A" di Amanthabagdon - Opera propria (dominio pubblico) via Commons Wikimedia