Differenza tra Sanger Sequencing e Pyrosequencing

Differenza chiave - Sequenziamento di Sanger e Pyrosequencing
 

Il sequenziamento del DNA è molto importante per l'analisi del DNA poiché la conoscenza della corretta disposizione dei nucleotidi su una particolare regione del DNA rivela molte importanti informazioni a riguardo. Esistono diversi metodi di sequenziamento del DNA. Sequenziamento di Sanger e Pyrosequencing sono due metodi di sequenziamento del DNA ampiamente utilizzati in Biologia Molecolare. La differenza chiave tra sequenziamento di Sanger e Pyrosequencing è quella Il sequenziamento Sanger utilizza i dideossinucleotidi per terminare la sintesi del DNA per leggere la sequenza nucleotidica mentre il pirosequenziamento rileva il rilascio del pirofosfato incorporando i nucleotidi e sintetizzando la sequenza complementare per leggere l'ordine preciso della sequenza.

CONTENUTO
1. Panoramica e differenza chiave
2. Cos'è il sequenziamento di Sanger
3. Cos'è il Pyrosequencing
4. Confronto affiancato - Sequenziamento di Sanger e Pirosequenziamento
5. Sommario

Cos'è il sequenziamento di Sanger?

Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA di prima generazione sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi college nel 1977. È noto anche come Sequenza di terminazione della catena o Sequencing di tipo dideoxy poiché si basa sulla terminazione della catena da parte dei dideossinucleotidi (ddNTP). Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per oltre 30 anni fino a quando non è stato sviluppato il New Generation Sequencing (NGS). La tecnica di sequenziamento di Sanger ha permesso la scoperta del corretto ordine di nucleotide o l'attaccamento di un particolare frammento di DNA. Si basa sull'incorporazione selettiva di ddNTP e sulla terminazione della sintesi del DNA durante il in vitro Replicazione del DNA. L'assenza di gruppi 3 'OH per continuare la formazione del legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti è una caratteristica unica di ddNTPs. Quindi, una volta collegato il ddNTP, l'allungamento della catena cessa e termina da quel punto. Ci sono quattro ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP - usati nel sequenziamento di Sanger. Questi nucleotidi arrestano il processo di replicazione del DNA quando vengono incorporati nel filamento in crescita del DNA e risultano in lunghezze variabili di DNA corto. L'elettroforesi su gel capillare viene utilizzata per organizzare questi brevi filamenti di DNA in base alle loro dimensioni su un gel, come mostrato nella Figura 01.

Figura 1: elettroforesi su gel capillare di DNA breve sintetizzato

Per in vitro replica del DNA, dovrebbero essere forniti alcuni requisiti. Sono enzima DNA polimerasi, DNA modello, primer oligonucleotidici e deossinucleotidi (dNTP). Nel sequenziamento di Sanger, la replicazione del DNA viene eseguita in quattro provette separate insieme a quattro tipi di ddNTP separatamente. I deossinucleotidi non sono totalmente sostituiti dai rispettivi ddNTP. Una miscela del particolare dNTP (ad esempio, dATP + ddATP) è inclusa nel tubo e replicata. Su quattro gel separati, quattro prodotti a tubo separati vengono fatti girare su un gel. Quindi leggendo il gel, la sequenza può essere costruita come mostrato nella Figura 02.

Figura 02: Sequenziamento di Sanger

Il sequenziamento di Sanger è una tecnica importante che aiuta in molte aree della biologia molecolare. Il progetto sul genoma umano è stato completato con successo con l'ausilio di metodi basati sul sequenziamento di Sanger. Il sequenziamento di Sanger è utile anche per sequenziamento del DNA bersaglio, ricerca sul cancro e sulle malattie genetiche, analisi dell'espressione genica, identificazione umana, rilevamento di patogeni, sequenziamento microbico, ecc..

Esistono diversi svantaggi del sequenziamento di Sanger:

• La lunghezza del DNA che viene sequenziato non può essere più lunga di 1000 coppie di basi
• Solo un filo può essere sequenziato alla volta.
• Il processo è lungo e costoso.

Pertanto, nuove tecniche avanzate di sequenziamento sono state sviluppate con il tempo per superare questi problemi. Tuttavia, il sequenziamento Sanger è ancora in uso a causa dei risultati estremamente accurati fino a circa 850 frammenti di lunghezza della coppia di basi.

Cos'è il Pyrosequencing?

Pyrosequencing è una nuova tecnica di sequenziamento del DNA basata sul "sequenziamento per sintesi". Questa tecnica si basa sulla rivelazione del rilascio di pirofosfato sull'integrazione del nucleotide. Il processo è impiegato da quattro diversi enzimi: DNA polimerizzato, ATP sulfurilasi, luciferasi e apirasi e due substrati adenosina 5 'fosfosfato (APS) e luciferina.

Il processo inizia con il primer che si lega con il modello di DNA a filamento singolo e la DNA polimerasi avvia l'incorporazione di nucleotidi complementari ad esso. Quando i nucleotidi si uniscono (polimerizzazione dell'acido nucleico), rilascia gruppi pirofosfati (due gruppi fosfati uniti) ed energia. Ogni aggiunta di nucleotidi rilascia quantità equimolare di pirofosfato. Il pirofosfato si converte in ATP con ATP sulfurilasi in presenza del substrato APS. L'ATP generato determina la conversione mediata dalla luciferasi della luciferina in ossiluciferina, producendo luce visibile in quantità proporzionale alla quantità di ATP. La luce viene rilevata da un dispositivo di rilevamento di fotoni o da un fotomoltiplicatore e crea un pirogramma. L'apirase degrada l'ATP e i dNTP non incorporati nella miscela di reazione. L'aggiunta dNTP viene eseguita una volta alla volta. Poiché l'aggiunta del nucleotide è nota in base all'incorporazione e al rilevamento della luce, è possibile determinare la sequenza del modello. Il pirogramma viene utilizzato per generare la sequenza nucleotidica del DNA campione, come mostrato nella Figura 03.

La pirosequenziazione è molto importante nell'analisi del polimorfismo a singolo nucleotide e nel sequenziamento di brevi tratti di DNA. L'elevata precisione, flessibilità, facilità di automazione e elaborazione parallela sono i vantaggi del pirosequenziamento rispetto alle tecniche di sequenziamento Sanger.

Figura 03: Pyrosequencing

Qual è la differenza tra Sanger Sequencing e Pyrosequencing?

Sequenziamento di Sanger vs Pyrosequencing
Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA basato sull'incorporazione selettiva di ddNTPs mediante DNA polimerasi e terminazione della catena.	Il pirosequenziamento è un metodo di sequenziamento del DNA basato sulla rivelazione del rilascio di pirofosfato in seguito all'incorporazione del nucleotide.
Uso di ddNTP
ddNTPs sono usati per terminare la replicazione del DNA	ddNTPs non sono usati.
Enzimi coinvolti
Vengono utilizzate DNA polimerasi.	Vengono utilizzati quattro enzimi: DNA polimerasi, ATP sulfurilasi, Luciferasi e Apirasi.
Substrati usati
APS e Luciferin non sono usati.	Si utilizzano fosfosulfato di adenosina 5 '(APS) e luciferina.
Temperatura massima
Questo è un processo lento.	Questo è un processo veloce.

Riassunto: Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Sequenziamento di Sanger e Pyrosequencing sono due metodi di sequenziamento del DNA utilizzati in biologia molecolare. Il sequenziamento di Sanger costruisce l'ordine dei nucleotidi in sequenza terminando l'allungamento della catena mentre il pirosequenzia costruisce l'ordine preciso dei nucleotidi in sequenza mediante l'incorporazione di nucleotidi e rilevando il rilascio di pirofosfati. Pertanto, la principale differenza tra sequenziamento di Sanger e Pyrosequencing è che il sequenziamento di Sanger funziona sul sequenziamento tramite terminazione di catena mentre il pirosequenziamento funziona sul sequenziamento per sintesi.

Riferimento:
1. Fakruddin, Md e Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing: un'alternativa al sequenziamento tradizionale di Sanger." American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Pubblicazioni scientifiche, 02 marzo 2012. Web. 28 febbraio 2017.
2. "Sequenziamento di Sanger". Sequenziamento di Sanger - Argomenti ScienceDirect. N., n. Web. 28 febbraio 2017

Cortesia dell'immagine:
1. "Didesoxy-Methode" di Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) attraverso Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" di Enzo in lingua polacca Wikipedia (CC BY-SA 3.0) attraverso Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" per microbiologia (CC BY-SA 2.0) attraverso Flickr