Differenza tra microarray e sequenziamento dell'RNA

Differenza chiave - Microarray vs RNA Sequencing
 

Il trascrittoma rappresenta l'intero contenuto di RNA presente in una cellula comprendente mRNA, rRNA, tRNA, RNA degradato e RNA non degradato. La trascrizione del profilo è un processo importante per comprendere le intuizioni della cellula. Esistono diversi metodi avanzati per la profilatura del trascrittoma. Microarray e sequenziamento dell'RNA sono due tipi di tecnologie sviluppate per analizzare il trascrittoma. La differenza chiave tra microarray e sequenziamento dell'RNA è questa microarray si basa sul potenziale di ibridazione di sonde pre-marcate con sequenze target di cDNA mentre il sequenziamento dell'RNA si basa sul sequenziamento diretto dei filamenti di cDNA mediante tecniche avanzate di sequenziamento come NGS. Il microarray viene eseguito con la conoscenza precedente delle sequenze e il sequenziamento dell'RNA viene eseguito senza la conoscenza preliminare delle sequenze.

CONTENUTO
1. Panoramica e differenza chiave
2. Cos'è Microarray
3. Cos'è il sequenziamento dell'RNA
4. Confronto fianco a fianco - Microarray vs RNA Sequencing
5. Sommario

Cos'è Microarray?

Microarray è un metodo robusto, affidabile e ad alta produttività utilizzato per il tracciamento del trascrittoma da parte degli scienziati. È l'approccio più popolare per l'analisi di trascrizione. È un metodo a basso costo, che dipende dalle sonde di ibridazione.

La tecnica inizia con l'estrazione di mRNA dal campione e la costruzione della libreria di cDNA dall'RNA totale. Quindi viene miscelato con sonde predesegnate con etichetta fluorescente su una superficie solida (matrice spot). Sequenze complementari ibridizzano con le sonde etichettate nel microarray. Quindi il microarray viene lavato e schermato e l'immagine viene quantificata. I dati raccolti devono essere analizzati per ottenere i relativi profili di espressione.

Si assume che l'intensità delle sonde di microarray sia proporzionale alla quantità di trascritti nel campione. Tuttavia, l'accuratezza della tecnica dipende dalle sonde progettate, dalla conoscenza preliminare della sequenza e dall'affinità delle sonde per l'ibridazione. Quindi la tecnologia dei microarray ha dei limiti. La tecnica dei microarray non può essere eseguita con trascritti a bassa abbondanza. Non riesce a differenziare le isoforme e identificare le varianti genetiche. Poiché questo metodo dipende dall'ibridazione delle sonde, alcuni problemi legati all'ibridazione come ibridazione incrociata, ibridazione non specifica ecc. Si verificano nella tecnica dei microarray.

Figura 01: Microarray

Cos'è il sequenziamento dell'RNA?

Sequenziamento shotgun RNA (RNA seq) è una tecnica di sequenziamento dell'intero trascrittoma sviluppata di recente. È un metodo di analisi del transcriptoma rapido e ad alto rendimento. Esso quantifica direttamente l'espressione di geni e risultati in un'indagine approfondita del trascrittoma. L'RNA seq non dipende da sonde prestabilite o da una precedente conoscenza delle sequenze. Pertanto, il metodo RNA seq ha un'alta sensibilità e capacità di rilevare nuovi geni e varianti genetiche.

Il metodo di sequenziamento dell'RNA viene eseguito tramite diversi passaggi. L'RNA totale della cellula deve essere isolato e frammentato. Quindi, usando la trascrittasi inversa, una libreria di cDNA deve essere preparata. Ogni filo del cDNA deve essere legato con gli adattatori. Quindi i frammenti ligati devono essere amplificati e purificati. Infine, utilizzando un metodo NGS, è necessario eseguire il sequenziamento del cDNA.

Figura 02: Sequenziamento dell'RNA

Qual è la differenza tra Microarray e sequenziamento dell'RNA?

Microarray vs RNA Sequencing
Microarray è un metodo robusto, affidabile e ad alta produttività.	Il sequenziamento dell'RNA è un metodo accurato e ad alto rendimento.
Costo
Questo è un metodo a basso costo.	Questo è un metodo costoso.
Analisi di un numero elevato di campioni
Ciò facilita l'analisi di un gran numero di campioni contemporaneamente.	Ciò facilita l'analisi di un numero elevato di campioni.
Analisi dei dati
L'analisi dei dati è complessa.	Più dati sono generati in questo metodo; quindi, il processo è più complesso.
Conoscenza precedente delle sequenze
Questo metodo è basato su sonde di ibridazione, quindi è richiesta una conoscenza preliminare delle sequenze.	Questo metodo non dipende dalla conoscenza della sequenza precedente.
Variazioni strutturali e nuovi geni
Questo metodo non è in grado di rilevare variazioni strutturali e nuovi geni.	Questo metodo può rilevare variazioni strutturali come fusione del gene, splicing alternativo e nuovi geni.
sensibilità
Questo non può rilevare differenze nell'espressione delle isoforme, quindi questo ha una sensibilità limitata.	Questo ha un'alta sensibilità.
Risultato
Questo può solo portare a livelli di espressione relativa. Questo non fornisce una quantificazione assoluta dell'espressione genica.	Fornisce livelli di espressione assoluti e relativi.
Data Reanalysis
Questo deve essere rieseguito per poter rianalizzare.	I dati di sequenziamento possono essere rianalizzati.
Necessità di personale specifico e infrastrutture
Infrastruttura e personale specifici non sono necessari per microarray.	Infrastruttura e personale specifici richiesti dal sequenziamento dell'RNA.
Problemi tecnici
La tecnica dei microarray presenta problemi tecnici come ibridazione incrociata, ibridazione non specifica, velocità di rilevamento limitata delle singole sonde, ecc..	La tecnica RNA seq evita problemi tecnici come ibridazione incrociata, ibridazione non specifica, tasso di rilevamento limitato di sonde individuali, ecc..
pregiudizi
Questo è un metodo parziale poiché dipende dall'ibridazione.	Il bias è basso rispetto al microarray.

Riassunto - Microarray vs RNA Sequencing

I metodi di sequenziamento di microarray e RNA sono piattaforme ad alto throughput sviluppate per la profilatura del trascrittoma. Entrambi i metodi producono risultati altamente correlati ai profili di espressione genica. Tuttavia, il sequenziamento dell'RNA presenta vantaggi rispetto al microarray per l'analisi dell'espressione genica. Il sequenziamento dell'RNA è un metodo più sensibile per il rilevamento di trascritti a bassa abbondanza rispetto al microarray. Il sequenziamento dell'RNA consente anche la differenziazione tra isoforme e l'identificazione di varianti geniche. Tuttavia, il microarray è la scelta comune della maggior parte dei ricercatori poiché il sequenziamento dell'RNA è una tecnica nuova e costosa con le sfide di memorizzazione dei dati e l'analisi complessa dei dati.

Riferimenti:
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2.Rogler, Charles E., Tatyana Tchaikovskaya, Raquel Norel, Aldo Massimi, Christopher Plescia, Eugeny Rubashevsky, Paul Siebert e Leslie E. Rogler. "RNA espressione microarrays (REMs), un metodo ad alta velocità per misurare le differenze nell'espressione genica in diversi campioni biologici." Ricerca sugli acidi nucleici. Oxford University Press, 01 gennaio 2004. Web. 15 marzo 2017
3.Zhao, Shanrong, Wai-Ping Fung-Leung, Anton Bittner, Karen Ngo e Xuejun Liu. "Confronto di RNA-Seq e microarray nel profilo trascrittoma di cellule T attivate". PLOS ONE. Biblioteca pubblica delle scienze, gennaio 2014. Web. 15 marzo 2017

Cortesia dell'immagine:
1. “Journal.pcbi.1004393.g002” Di Malachi Griffith, Jason R. Walker, Nicholas C. Spies, Benjamin J. Ainscough, Obi L. Griffith - (CC BY 2,5) attraverso Commons Wikimedia
2. "Microarray" di Bill Branson (fotografo) - National Cancer Institute (dominio pubblico) via Commons Wikimedia