Differenza tra Gene Cloning e PCR

Differenza chiave - Gene Cloning vs PCR
 

La sintesi di molte copie di DNA da uno specifico frammento di DNA è chiamata amplificazione del DNA. Esistono due principali processi di amplificazione del DNA, cioè clonazione genica e PCR. La differenza chiave tra la clonazione del gene e la PCR è, la clonazione del gene produce le copie multiple di un gene specifico in vivo costruendo un DNA ricombinante e crescendo all'interno di un batterio ospite mentre la PCR produce milioni di copie di uno specifico frammento di DNA in vitro sottoposti a ripetuti cicli di denaturazione e sintesi.

CONTENUTO
1. Panoramica e differenza chiave
2. Cos'è Gene Cloning
3. Cos'è la PCR
4. Confronto affiancato - Gene Cloning vs PCR
5. Sommario

Cos'è Gene Cloning?

La clonazione genica è una tecnica impiegata per localizzare e moltiplicare un gene specifico dal DNA genomico estratto di un organismo attraverso la costruzione di DNA ricombinante. Il DNA genomico contiene migliaia di geni diversi codificati per proteine. Quando il DNA viene estratto, include tutti i possibili geni che può sopportare. La tecnica della clonazione genica ha consentito la rilevazione di un gene specifico dal DNA totale. Pertanto la clonazione genica è uno strumento importante nella biologia molecolare.

Realizzare una libreria genomica di un organismo è essenziale nella clonazione genica se non si ha la minima idea della posizione del gene rilevante nel DNA. Una libreria genomica viene creata utilizzando i seguenti passaggi.

Passo 1: Estrazione del DNA totale da un organismo che contiene il gene desiderato.

Passo 2: Digestione di restrizione del DNA estratto per produrre piccoli frammenti gestibili. Questo passaggio è facilitato dalle endonucleasi di restrizione.

Passaggio 3: Selezione di un vettore adatto e apertura del DNA vettoriale utilizzando le stesse endonucleasi di restrizione. I plasmidi batterici sono comunemente usati come vettori per trasportare DNA estraneo. I plasmidi sono piccoli cerchi di DNA situati all'interno dei batteri.

Passaggio 4: Combinazione del DNA vettoriale e del DNA frammentato per produrre una molecola di DNA ricombinante. Questo passaggio è governato dalla DNA ligasi.

Passaggio 5: Trasferimento di molecole di DNA ricombinante in batteri ospiti. Questo passaggio è noto come trasformazione e viene eseguito utilizzando uno shock termico.

Passaggio 5: Screening di cellule batteriche trasformate su un terreno di coltura. Alla fine del processo di trasformazione si ottiene una popolazione mista di cellule ospiti trasformate e non trasformate. Come gene di interesse include solo in cellule ospiti trasformate. Quindi, è necessario selezionare celle trasformate. La selezione viene effettuata utilizzando mezzi selettivi che contengono antibiotici. Solo le cellule trasformate crescono su questo mezzo di screening che consente la selezione.

Passaggio 6: Coltivazione di batteri per produrre una libreria di geni. In questa fase, le cellule ospiti trasformate vengono introdotte in terreni di coltura freschi che forniscono i requisiti di crescita ottimali. Le colonie totali sulle piastre di coltura rappresentano la libreria genomica di quell'organismo.

Step 7: La molecola di DNA ricombinante contenente il gene di interesse deve essere schermata da migliaia di frammenti clonati di DNA ricombinante. Può essere ottenuto mediante l'uso di sonde che contrassegnano il gene specifico o i risultati specifici della proteina da quel gene.

Una volta identificato il gene interessato contenente la colonia batterica dalle colonie totali, è possibile produrre milioni di copie del plasmide ricombinante che contiene il gene.

La clonazione genica viene utilizzata per stabilire librerie di geni, produrre proteine ​​speciali, vitamine, antibiotici, ormoni, sequenziare e mappare i genomi degli organismi, rendendo più copie di DNA di individui in medicina legale, ecc..

Figura_1: Gene Cloning

Cos'è la PCR?

Polymerase Chain Reaction (PCR) è una tecnica che genera un gran numero di copie di un particolare frammento di DNA. L'amplificazione esponenziale di una specifica sequenza di DNA è ottenuta mediante PCR sotto in vitro condizioni. Questa tecnica è uno strumento molto potente in Biologia Molecolare poiché può moltiplicare un piccolo campione di DNA in una quantità utilizzabile. La PCR fu introdotta da Kary Mullis nel 1983 e questa invenzione premiata creò un enorme progresso in Biologia Molecolare.

La tecnica PCR segue ripetute reazioni PCR come mostrato nella Figura 02. Una reazione PCR consiste in tre fasi principali che si verificano a tre diverse temperature; denaturazione di doppio filamento a DNA a 94 ⁰C, ricottura di primer a 68 ⁰Allungamento di C e di filo a 72 ⁰C. Pertanto, quando viene eseguita la PCR, la fluttuazione della temperatura deve essere mantenuta per una corretta replica. La PCR viene eseguita in una macchina PCR all'interno di provette per PCR. Le provette per PCR vengono caricate con miscele PCR corrette contenenti DNA modello, Taq polimerasi, primer, dNTP e buffer. La denaturazione del DNA del campione a doppio filamento in DNA a filamento singolo viene effettuata rompendo i legami a idrogeno tra le basi complementari a 94 - 98 ⁰C. Quindi singoli filamenti di DNA modello sono esposti per i primer. Dovrebbe essere fornita una coppia di primer (avanti e indietro) e dovrebbero essere termostabili per tollerare alte temperature. I primer sono sequenze di DNA corte a filamento singolo complementari alle estremità del frammento di DNA bersaglio. Primer sintetici sono utilizzati in PCR. I primer si legano alle basi complementari del DNA campione e iniziano la sintesi di un nuovo filamento. Questo passaggio è catalizzato da un enzima chiamato Taq polimerasi; un enzima DNA polimerasi termostabile isolato da Thermus auqaticus. Quando sono disponibili primer e nucleotidi (blocchi costitutivi), la Taq polimerasi costruisce il nuovo filamento di DNA complementare al DNA del modello. Alla fine del programma PCR, si osserva un frammento di DNA amplificato usando l'elettroforesi su gel. Se è necessaria un'ulteriore analisi, il prodotto PCR viene purificato dal gel.

La PCR è molto utile per la diagnosi e il monitoraggio di malattie genetiche e acquisite, identificazione di criminali (nel campo della medicina legale), studio della struttura e della funzione di un segmento mirato di DNA, sequenziamento e mappatura di genomi di organismi, ecc. PCR è diventato una tecnica di laboratorio di routine nei laboratori di ricerca di biologia medica e molecolare tra gli scienziati poiché ha una vasta gamma di applicazioni.

Figura_2: reazione a catena della polimerasi

Qual è la differenza tra Gene Cloning e PCR?

Gene Cloning vs PCR
La clonazione genica è il processo di creazione di copie multiple di un gene specifico in vivo attraverso il DNA ricombinante e trasformandosi in un batterio ospite.	La tecnica PCR produce copie multiple di una particolare sequenza di DNA in vitro attraverso cicli ripetuti di reazioni PCR.
Requisito di costruire il DNA ricombinante
Il DNA ricombinante viene prodotto per localizzare il gene.	Il DNA ricombinante non viene prodotto.
Bisogno di lavoro
Questo processo richiede molto lavoro.	Il lavoro intensivo non è necessario.
Processo in vivo o in vitro
La costruzione del DNA ricombinante è in vitro e l'amplificazione del DNA è in vivo.	L'amplificazione del DNA avviene completamente in vitro.

Riassunto - Gene Cloning vs PCR

La clonazione genica e la PCR sono due metodi usati per l'amplificazione del DNA. PCR è un in vitro processo che produce più copie del DNA di un particolare frammento di DNA senza utilizzare DNA ricombinante e un organismo ospite. La clonazione del gene è principalmente un in vivo processo che risulta in più copie di un gene interessato all'interno dell'organismo ospite tramite la costruzione di DNA ricombinante. Questa è la differenza tra la clonazione genica e la PCR.

Riferimento:
1. Griffiths, Anthony JF. "Clonazione di un gene specifico." Analisi genetica moderna. U.S. National Library of Medicine, 01 gennaio 1999. Web. 22 febbraio 2017
2. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." Centro nazionale per le informazioni sulle biotecnologie. U.S. National Library of Medicine, n. Web. 22 febbraio 2017

Cortesia dell'immagine:
1. "Figura 17 01 06" Di CNX OpenStax - (CC BY 4.0) attraverso Commons Wikimedia
2. "PCR" di Madprime - Opera propria (CC BY-SA 3.0) attraverso Commons Wikimedia